杭州甲型副傷寒分離菌株脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型

1、杭州甲型副傷寒分離菌株脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型                 【摘要】 目的 研究杭州部分地區(qū)甲型副傷寒暴發(fā)與散發(fā)分離菌株的分子流行病學(xué)關(guān)系及菌株耐藥狀況。方法 對(duì)20022005年杭州地區(qū)L縣和X區(qū)5起暴發(fā)疫情和10起散發(fā)病例的分離菌株，采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型方法進(jìn)行分子分型，采用紙片法（KB法）測(cè)定2種分離株的抗生素敏感性。結(jié)果 分離自2個(gè)地區(qū)的15株菌株被分為A、B、C、D共4 型，A、B、C等3個(gè)型密切近

2、緣，同屬一個(gè)克隆系。L縣2005年7月和8月2起暴發(fā)菌株和8月3株散發(fā)菌株的PFGE型別均屬B型，X區(qū)2004年12月和2005年9月的2起暴發(fā)菌株和9，10月的6株散發(fā)菌株的PFGE型別同屬C型。4個(gè)型別的菌株對(duì)復(fù)方磺胺甲唑和利福平均100%耐藥, 對(duì)頭孢唑啉、頭孢曲松、鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星、氯霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮均敏感, 對(duì)氨芐西林、多西環(huán)素和四環(huán)素等不同程度耐藥。結(jié)論 除1株散發(fā)菌株外，20022005年分離自杭州L縣和X區(qū)的甲型副傷寒病原菌屬于同一克隆系。散發(fā)病例可能均屬于暴發(fā)流行后的散發(fā)流行。 【關(guān)鍵詞】 甲型副傷寒沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulse field g

3、el electrophoresis, PFGE)分型為一種重復(fù)性好、分辨率高的細(xì)菌分子分型方法，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌感染的分子流行病學(xué)研究。近年來(lái)，杭州地區(qū)發(fā)生多起甲型副傷寒暴發(fā)疫情，部分地區(qū)反復(fù)多次發(fā)生，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本文應(yīng)用PFGE分型技術(shù)分析了20022005年杭州地區(qū)5起暴發(fā)疫情和10起散發(fā)病例的分子流行病學(xué)特征，并進(jìn)行抗生素敏感性觀察?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1 對(duì)象與方法11 菌株來(lái)源與鑒定 收集20022005年杭州市L縣和X區(qū)甲型副傷寒患者血培養(yǎng)及糞便中分離的甲型副傷寒沙門菌171株，其中分離自L縣3起暴發(fā)疫情103株，散發(fā)病例3株；分離自X區(qū)2起暴發(fā)疫情58株，散發(fā)病例7

4、株。菌株均由杭州市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科依據(jù)GB 16001-1995進(jìn)行鑒定。鑒定試劑：腸桿菌科鑒定試條ATB ID32E(法國(guó)生物梅里埃公司)；沙門菌診斷血清（成都生物制品所、蘭州生物制品所），均在有效期內(nèi)使用。 ,杭州甲型副傷寒分離菌株脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型 12 方法121 儀器與試劑 (1)主要儀器：CHEF DRII 脈沖場(chǎng)電泳儀、BioRad凝膠圖像分析系統(tǒng)、BioRad紫外分析儀(美國(guó)BioRad公司)。(2)主要試劑：蛋白酶K（上海Sangon公司）；XbaI(日本TaKaRa公司)；Seakem Gold瓊脂糖(美國(guó)Cambrex公司)、05×TBE(自行配制)

5、；Marker沙門菌Braenderup血清型H9812株（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)）。122 藥物敏感性試驗(yàn) 選擇14種抗生素，采用WHO推薦的改良Kirby-Bauer紙片法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。14種抗生素藥敏紙片、Mueller-Hinton瓊脂(杭州微生物試劑廠)，均在有效期內(nèi)使用。結(jié)果判定參照衛(wèi)生部制定的紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 125-1999）。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。123 PFGE分型 從每起暴發(fā)疫情分離菌株中各選擇1株以及散發(fā)病例分離株作為代表菌株，計(jì)15株；操作方

6、法按照美國(guó)疾病預(yù)防控制中心PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法1并略加改進(jìn)：Luria-Bertani（LB）平板劃菌37過(guò)夜,無(wú)纖維棉簽沾取細(xì)菌到25ml細(xì)菌懸浮液A600比濁，吸光度1214之間。于400l菌液加入20l蛋白酶K(20mg/ml)，再與等體積的預(yù)熔1%Seakem Gold瓊脂糖:1%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液混勻后，制備瓊脂塊。用50g/ml蛋白酶K液消化2h。分別用15ml雙蒸水和TE洗2和4次，消化和洗滌均在54搖床170r/min中進(jìn)行。然后切膠至15ml PE管中，于37水浴中以25U XbaI酶切2h。將膠條包埋于1%Seakem Gold瓊脂糖05×Tris-硼酸(T

7、BE)緩沖液。CHEFO電泳儀電泳19h,脈沖電泳起始轉(zhuǎn)換時(shí)間為22s、最后轉(zhuǎn)換時(shí)間為638s、電壓為6V/cm、角度120°，電泳液為05×TBE緩沖液，電流控制在140mA左右，電泳緩沖液溫度保持在14。溴化乙錠染色，凝膠圖像分析系統(tǒng)保存結(jié)果。分型判別標(biāo)準(zhǔn)：按文獻(xiàn)判別標(biāo)準(zhǔn)2, 酶切后圖譜完全一致,判定為同一型；酶切后圖譜有13條條帶不同者，判定為菌株間關(guān)系較密切；酶切后圖譜如有3條以上條帶不同者，則判定為菌株間關(guān)系不密切。同時(shí)采用Dice相似性系數(shù)評(píng)估PFGE圖譜間的相似性3，應(yīng)用Quantity one軟件計(jì)算電泳條帶分子量。2 結(jié)果21 PFGE分型 分型結(jié)果可見(jiàn)，

8、15株甲型副傷寒沙門菌分別產(chǎn)生1920條條帶，可分為A、B、C、D等4種型別,帶型變化分別發(fā)生在6511，4016，3275，746，411Kb處，4型之間分別有14 條電泳條帶的差異（圖1）。M：Marker(XbaI 酶切H9812株)；1：A型；37：B型；2,8,9,1115：C型；10：D型圖1 15株甲型副傷寒沙門菌PFGE分型圖譜（略）其中分離自2002年3月L縣1起暴發(fā)疫情的菌株為A型；分離自2005年7月、8月L縣2起暴發(fā)疫情以及2005年8月該縣3起散發(fā)病例菌株為B型；分離自2004年12月、2005年9月X區(qū)2起暴發(fā)疫情以及2005年9，10月該區(qū)6起散發(fā)病例的菌株為C型

9、；分離自2005年9月X區(qū)1起散發(fā)病例的菌株為D型。4型菌株之間的Dice系數(shù)分析表明,除分離自X區(qū)2005年的1株散發(fā)菌株外(D型)，其他14株菌株間PFGE型別的Dice系數(shù)均>09。22 抗生素敏感性比較 4個(gè)型別的甲型副傷寒沙門菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢曲松、鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星、氯霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃唑酮均敏感（100%），對(duì)復(fù)方磺胺甲唑和利福平均100%耐藥。其中94株A型菌株對(duì)多西環(huán)素耐藥率為67，對(duì)四環(huán)素耐藥率為0，對(duì)氨芐西林耐藥率為100；12株B型菌株對(duì)多西環(huán)素和四環(huán)素耐藥率均為0，對(duì)氨芐西林耐藥率為167；64株C型菌株對(duì)多西環(huán)素耐藥率為203，對(duì)四環(huán)素耐藥

10、率為47，對(duì)氨芐西林耐藥率為141；1株D型菌株對(duì)多西環(huán)素和四環(huán)素耐藥率均為0，對(duì)氨芐西林耐藥率為100。3 討論本文結(jié)果顯示，除分離自X區(qū)2005年的1株D型散發(fā)菌株外，其他14株菌株間PFGE型別的Dice系數(shù)均>09，表明2個(gè)地區(qū)的暴發(fā)或散發(fā)疫情分離到的甲型副傷寒沙門菌株關(guān)系密切，同屬一個(gè)克隆系。其中占比例較大的A型與C型分別與朱水榮等420012004年分離自臨安與義烏、常山與溫嶺等地菌株的PFGE分型一致，表明杭州地區(qū)20022005年分離自L縣和X區(qū)的流行菌株與浙江省其他地區(qū)的流行菌株也存在密切關(guān)系。本文結(jié)果顯示，分離自L縣2005年7月和8月的2起暴發(fā)疫情和同年8月的3起散

11、發(fā)病例菌株的PFGE圖譜完全一致，同屬B型；分離自X區(qū)2004年12月和2005年9月的2起暴發(fā)疫情和2005年9月和10月的6起散發(fā)病例菌株的PFGE圖譜完全一致，同屬C型。提示暴發(fā)菌株與散發(fā)菌株間均呈現(xiàn)極為緊密關(guān)系，從發(fā)病時(shí)間推測(cè)，散發(fā)病例可能均屬繼當(dāng)?shù)乇┌l(fā)流行后的散發(fā)流行，其傳染源可能與暴發(fā)傳染源相同，即導(dǎo)致暴發(fā)的傳染源可能未完全被發(fā)現(xiàn)或消毒不徹底；或者直接源自暴發(fā)病例或帶菌者。同時(shí)，杭州地區(qū)已經(jīng)開(kāi)始有多重耐藥的甲型副傷寒沙門菌菌株出現(xiàn)，應(yīng)加強(qiáng)菌株耐藥性的監(jiān)測(cè)，根據(jù)藥敏結(jié)果來(lái)指導(dǎo)臨床用藥和接觸人群的預(yù)防性用藥，從而更有效地防治甲型副傷寒。杭州甲型副傷寒分離菌株脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型(2)歡迎

12、您訪問(wèn)范,文,家靜慰嘉南住?/STRONG>1 Centers for Disease Control and Prevention.Standardized laboratory protocol for molecular subtyping of escherichia coli O157:H7,non-typhoidal salmonella serotypes,and shigella sonnei by pulsed field gel electrophoresis(PFGE)S.Pulse Net,the National Molecular Subtyping Netw

13、ork for Foodborne Disease Surveillance.,Atlanta Ga:Centers for Disease Control and Prevention,2004:24-28.2 Tenover FC,Arbeit RD,Goering RV,et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electhophoresis:criteria for bacterial strain typingJ.Clin Microbiol,1995,33(9):2233-2239.3 Thong KL,Cordano AM,Yassin RM,et al.Molecular analysis of environmental and human isolates of salmonella typhiJ.Applied and Environmental Microbiology,19