WB實(shí)驗(yàn)基本步驟說課講解

1、WB 實(shí) 驗(yàn) 基 本 步 驟實(shí)驗(yàn)基本步驟提取細(xì)胞蛋白BCA定量制備蛋白膠（SDS-PAGE交）蛋白樣品變性電泳轉(zhuǎn)膜圭封閉一抗TBST洗滌二抗TBST洗滌顯影結(jié)果分析試劑配制1. PBS磷酸鹽緩沖溶液1L磷酸二氫鉀0.24g磷酸氫二鈉1.44g氯化鈉8g氯化鉀0.2g加入500ml純水，調(diào)PH=7.2定容至1L,高壓蒸汽滅菌2. PBST （ PBS+0.05% 吐溫-20）500mlPBS+0.25ml 吐溫-203. 電轉(zhuǎn)液500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇，置于4 C冰箱預(yù)冷4. 電泳液（1X）10x稀釋，50ml10x電泳液+450ml純水5.

2、 TBS6. TBST （TBS+0.05% 吐溫-20）50mlTBS+450ml 純水 +0.25ml 吐溫-207. 封閉液TBST1X+5% 奶粉40ml封閉液=40mlTBST+2g 奶粉，40 C預(yù)熱WB實(shí)驗(yàn)、蛋白樣品制備準(zhǔn)備:一管細(xì)胞，PBS （4C預(yù)冷），PMSF （100mM），移液槍（1000ul, 10ul）, 1.5mlEP 管2個(gè)，高速冷凍離心機(jī)4C預(yù)冷1. 于-20C冰箱中取出一管細(xì)胞樣品，吸去培養(yǎng)液2加入1ml 4C預(yù)冷的PBS （0.01M pH7.27.3）。用移液槍輕輕吹成懸浮液后 4C, 8000r離心5min，然后棄去上清。重復(fù)以上操作一次，共洗細(xì)胞兩次

3、以洗去培養(yǎng)液。3. 按1ml裂解液加10山PMSF （100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可 與裂解液混合。）4. 在樣品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹勻，于冰上裂解 30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng) 瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。5. 裂解完后，于4°C下12000 rpm離心5 min。7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 0.5 ml的離心管中放于20C保存。二、蛋白含量的測(cè)定（BCA定量）準(zhǔn)備：96 孔板，移液槍（1000ul，10ul，200ul ），BCA 工作液（A+B ），50mlEP 管，1xPBS，BSA標(biāo)準(zhǔn)液1. 將96孔板分好區(qū)域，若不夠分則只做兩

4、個(gè)重復(fù)，（外圍一圈的孔最好不用）2. 算好孔數(shù)（總的）每孔加 200ulBCA工作液（A+B ），（ A液：B液=50:1, 一般配多些，如 60 孔，A 液 12000ul，B 液 240ul）3. 將樣品稀釋到一定倍數(shù)才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul樣品（2ul樣品+18ulPBS,即稀釋10倍），做三個(gè)重復(fù)則需要 60ul, 般配80ul4. 配蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，將2mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.5mg/ml，若配200ul的0.5mg/ml蛋白 標(biāo)準(zhǔn)溶液則需要50ul的2mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和150ul PBS溶液5. 將稀釋好的樣品加入孔板中（標(biāo)記的區(qū)域），

5、接著標(biāo)準(zhǔn)品按0, 1,2,4,8,12,16,20ul加到標(biāo)號(hào)的區(qū)域，之后在加標(biāo)準(zhǔn)樣品的孔內(nèi)，將孔內(nèi)溶液用PBS補(bǔ)足到20ul6. 每孔加200ul配好的工作液，平行加，不能上下加，以減少誤差7. 將加好的96孔板放在37C下孵育30分鐘8. 孵育完后，放在酶標(biāo)儀輕微震蕩3-10s,中速，吸光值595nm進(jìn)行比色測(cè)定,記錄標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品 吸光值數(shù)據(jù)后，以蛋白含量（ml）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（R2 >0.98才有用, 酶標(biāo)儀操作：兩個(gè)箭頭圖標(biāo),1是結(jié)果,2是保存）9. 計(jì)算蛋白含量（注意定量樣品已經(jīng)稀釋了10倍）蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣量骨口. 序號(hào)12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白量

6、/ul01248121620(0.5mg/ml )背景液（PBS /ul2019181612840標(biāo)準(zhǔn)液濃度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、SDS- PAGE電泳1. 配膠（12%,可以提前配好）準(zhǔn)備：玻璃板，梳子，AP （解凍，現(xiàn)拿現(xiàn)用），聚丙烯酰胺（4 C冰箱冷藏）（1）玻璃板驗(yàn)漏5min(2) 按表配置分離膠(3) 灌膠，加酒精封壓，凝30min (注意不要有氣泡)(4) 按表配濃縮膠，倒掉酒精，用吸水紙吸去酒精，灌膠，插梳子(注意不要有氣泡)，凝30mi n(5) 取膠，用水沖洗一下濃縮膠，加少量水放入一次性手套中4°C冰箱保存?zhèn)溆?. 樣品處

7、理準(zhǔn)備：PBS,移液槍，1.5mlEP管(1) 稀釋樣品：一般每孔上樣5ul，即1mg/ml濃度的樣品，測(cè)完蛋白含量后，將樣品用PBS稀釋至1mg/ml (注意load in gbuffer的加入也得算入)(2) 取出上樣樣品15ul至1.5 ml離心管中，加入6XSDS上樣緩沖液3ul至終濃度為1XC(上樣總體積一般不超過15 d，加樣孔的最大限度可加20 pl樣品。)(3) 將樣品在100C煮5 min震蕩使蛋白完全變性(注意儀器操作)3. 電泳準(zhǔn)備：電泳液500ml (現(xiàn)配)，蛋白膠，10ul移液槍(槍頭)，樣品，Marker，冰盒，電泳 裝置(1) 將SDS-PAGE膠放入電泳槽中，加

8、足夠的電泳液。(短玻璃板面向內(nèi)，長(zhǎng)玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。電泳液至少要漫過內(nèi) 測(cè)的短玻璃板。注意先檢漏。)(2) 上樣。用移液槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3次，以免交叉污染。)(3) 先設(shè)置80V，開始電泳，樣品溴酚藍(lán)跑至分離膠后增至120V電壓，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。（此時(shí)準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)液）四、轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備：電轉(zhuǎn)液（現(xiàn)配4C冰箱冷藏），鑷子，濾紙，PVDF膜（0.45um）,電轉(zhuǎn)

9、裝置，冰盒 注意：拿濾紙和膜時(shí)一定要戴手套或用鑷子，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。1. 在加有轉(zhuǎn)移液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊2. 濾紙浸入電轉(zhuǎn)液中，PVDF膜在甲醇中潤(rùn)濕成半透明，小心將膜放入 4C電轉(zhuǎn)液中平衡至少 5min。3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的 氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先 疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。4. 先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻 璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很

10、易裂。）除去小玻璃板后，將 濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上（做好標(biāo)記），用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整 個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙 不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使 空氣流通。）5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中（電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，漿槽放入冰中），要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾 的白面對(duì)槽的紅面。一般用100mA轉(zhuǎn)移90min。6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1

11、X麗春紅染液染5 min （于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。（準(zhǔn)備封閉液）六、免疫反應(yīng)準(zhǔn)備：封閉液，一抗，二抗，TBST1 .將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉2h。2. TBST洗4次。每次5分鐘。3將膜按照目的蛋白所處位置剪切并做好標(biāo)記，加入相對(duì)應(yīng)的一抗，室溫孵育2h或者4C過夜4. 室溫下孵育12 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次 5min5. 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育12 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗4次，每次5 min七、顯影準(zhǔn)備：樣品膠片，移液槍（200ul）,中槍頭，吸水紙，顯影液（A+B ），薄鑷子二抗一抗目的蛋白 78kd Bip 1:1000兔二抗75kd目的蛋白 34kd GAPDH內(nèi)參