高壓冷凍及冷凍替代技術(shù)電鏡制樣

1、高壓冷凍及冷凍替代技術(shù)電鏡制樣高壓冷凍及冷凍替代技術(shù)電鏡制樣，是用高壓冷凍儀把生物樣品中的水快速冷凍，形成玻璃化的冰，從而保護(hù)生物樣品的超微結(jié)構(gòu)不被破壞。然后將生物樣品轉(zhuǎn)移到冷凍替代儀中，經(jīng)過低溫脫水，化學(xué)固定，包埋劑滲透和聚合，然后切片和染色，最后透射電鏡觀察。與常規(guī)化學(xué)固定制樣相比具有顯著的優(yōu)勢，能更真實的保存生物樣品的超微結(jié)構(gòu)。目前細(xì)胞分析技術(shù)平臺擁有高壓冷凍儀Leica EM PACT2（如圖一）和冷凍替代儀Leica EM AFS2（如圖二）。圖二、冷凍替代儀Leica EM AFS2圖一、高壓冷凍儀Leica EM PACT2該制樣方法在應(yīng)用過程中，生物樣品中的水極易形成冰晶（如圖

2、三），破壞超微結(jié)構(gòu)。為了降低冰晶產(chǎn)生的可能性，我們在上樣和冷凍替代上做了以下改進(jìn)：一、上樣除了不能有氣泡，還要保證加入填充液（1-Hexadecene）的液面要略高于Carrier。以往經(jīng)驗要求填充液液面恰好與Carrier水平，一般很難做到，若把握不好液面略低于Carrier，就會形成空腔，導(dǎo)致高壓冷凍的失敗。若略高于Carrier，就不會有這樣的問題，降低了冰晶產(chǎn)生的可能性。二、高壓冷凍之后，樣品轉(zhuǎn)移到裝有冷凍替代液的凍存管里，然后轉(zhuǎn)移到冷凍替代中，整個過程樣品都有液氮保護(hù)，防止由于樣品回溫導(dǎo)致冰晶的產(chǎn)生。三、樣品進(jìn)入冷凍替代后，要用預(yù)冷的解剖針沿著樣品劃個圈，1-Hexadecene低溫

3、下可能會阻止冷凍替代液接觸樣品，劃圈之后樣品更有利于冷凍替代液與樣品接觸。四、根據(jù)冷凍替代儀樣品腔的大小，我們自己設(shè)計一款凍存管架（如圖四）。與之前管架相比，這款凍存管架有以下特點(diǎn)：1、各個腔室彼此獨(dú)立，受環(huán)境熱空氣影響??；2、鋁制管架，溫度調(diào)控更快更準(zhǔn)確。3、操作更加便捷。NMi圖四、凍存管管架實物圖圖三、冰晶破壞的細(xì)胞以細(xì)胞和小鼠肝臟組織為例，高壓冷凍和冷凍替代技術(shù)制樣，得到細(xì)胞和小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)（如圖五和圖六）。樣品制備具體操作如下：圖六、小鼠肝臟細(xì)胞中的線粒體圖五、Hela細(xì)胞中的高爾基體1 取樣1.1 懸浮細(xì)胞：取適量的細(xì)胞懸浮液，低速離心成細(xì)胞團(tuán)，去上清，細(xì)胞團(tuán)呈米糊狀，用移液槍取

4、適量細(xì)胞，填滿Carrier，加入適量冷凍保護(hù)液1-Hexadecene，濾紙吸取多余液體，使冷凍保護(hù)液液面略高于Carrier。1.2 小鼠肝臟：從活體上取出的組織，先用鋒利的刀片在低溫下切成盡可能薄片狀，從中挑選合適的部分切下來，然后裝入Carrier，加入適量冷凍保護(hù)液1-Hexadecene，濾紙吸取多余液體，使冷凍保護(hù)液液面略高于Carrier。2高壓冷凍高壓冷凍儀在使用前，要先做一些準(zhǔn)備工作：加入足夠的液氮和壓力液甲基環(huán)己烷，然后用空載的carrier高壓冷凍三次，保證高壓冷凍儀在最佳工作狀態(tài)。2.1 將上述裝有樣品的carrier快速安置到高壓冷凍儀，準(zhǔn)備高壓冷凍。2.2高壓冷凍

5、樣品，迅速把樣品冷凍，并做好記錄。通過高壓冷凍儀冷凍樣品后產(chǎn)生的冷凍速度和壓力變化曲線，以此選擇冷凍效果較好的樣品繼續(xù)下面實驗。2.3轉(zhuǎn)移樣品，首先把現(xiàn)配的替代液1%鋨酸（0.5g鋨酸溶于50mL丙酮）分裝到2mL凍存管中，迅速放入液氮冷凍備用，冷凍過程中保持冷凍管直立。與此同時，冷凍替代儀加滿液氮，將自制的凍存管架放入樣品腔，預(yù)冷至-100。用預(yù)冷的鑷子，在液氮下將Carrier分別裝入凍存管，凍存管蓋不宜擰的過緊，然后迅速轉(zhuǎn)移到冷凍替代儀樣品腔室的凍存管架里。3 冷凍替代冷凍替代-9012h后，用預(yù)冷的解剖針沿樣品劃一圈，便于替代液接觸樣品，加速替代。步驟溫度時間1-100 -904h2-

6、9048h3-90 -608h4-608h5-60 -304h6-308h7-30 -202h8-208h9-20 42h1041h溫度達(dá)到4后，用4的丙酮浸洗樣品3次，每次15分鐘。此過程中，會有部分樣品與Carrier分離，若還有沒分離的可以用解剖針將樣品從Carrier中剝離。4 滲透包埋分別用以下滲透液滲透。步驟滲透液濃度時間1Epon812/丙酮1:11.5-2h2Epon812/丙酮3:16-12h3Epon812100%1h4Epon812100%8h5Epon812100%1h然后將樣品轉(zhuǎn)移至包埋槽，60烘箱聚合48h。5 超薄切片與染色將聚合的包埋塊用超薄切片機(jī)切出70 nm的薄片，用鍍膜載網(wǎng)撈片，并鉛鈾染色。6 電鏡觀察在透射電鏡下觀察，找到感興趣區(qū)域，放大拍照。注意事項：1. 取樣時，動作要盡可能快，避免生物樣品發(fā)生自溶破壞超微結(jié)構(gòu)。2. 上樣過