I-B-Svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的基因編輯

1、I-B-Svi型 CRISPR-Cas系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的基因編輯谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)是一種不具有 CRISPR-Cas系統(tǒng)的生產(chǎn)氨基酸的重要工業(yè)微生物, 在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生許多有用的代謝產(chǎn)物,如 : 谷氨酸、丁二烯等 , 在工業(yè)生產(chǎn)中有非常重要的地位。 隨著基因工程和基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展 , 很多研究人員試圖在基因水平上人工掌控微生物的生長和代謝 , 以使利益最大化。但因谷氨酸棒狀桿菌與 Cas9 存在生物相容性問題 ( 表達(dá) Cas9 的菌株無法生長 ), 目前 CRISPR/Cas9系統(tǒng)無法直接應(yīng)用于谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯中。

2、基因組編輯技術(shù) ( 簡稱基因編輯技術(shù) ) 與常說的基因工程一樣都是改變細(xì)胞的遺傳特性 , 但不同點主要在于基因編輯技術(shù)直接針對細(xì)胞的染色體 , 從而使其功能遠(yuǎn)大于依靠載體的傳統(tǒng)基因工程。CRISPR-Cas是原核中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng) , 是最前沿的基因編輯技術(shù) , 可對原核和真核細(xì)胞基因組中的基因進行缺失、插入、和替換 , 且具有簡單、快速和有效的顯著的優(yōu)勢。文獻報道的能夠進行基因編輯的方法主要包括2類II型(CRISPR/Cas9)和 V 型 (Cpfl/Cas12a),尤以化膿鏈球菌中的II型 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。但該系統(tǒng)也具有其局限性, 如: 脫靶和生物相容性等。 I

3、型 CRISPR-Cas系統(tǒng)是自然界中最常見的類型, 該系統(tǒng)中的 Cas3在降解 DNA時通常是逐步降解而不是直接產(chǎn)生雙鏈斷裂 , 這也可能是為什么 I 型 CRISPR-Cas系統(tǒng)是自然界中最常見的原因。然而 , 迄今為止 , 除本實驗室外 , 源自 I 型 CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯工具未見報道。本實驗室從化工制藥廠的活性污泥中分離得到一株能夠以甾體化合物為唯一碳源進行生長的放線菌, 我們將其命名為 : 維吉尼亞鏈霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14),該菌株的全基因組測序分析發(fā)現(xiàn): 基因組上存在一個 I-B-Svi型 CRISPR-Cas系統(tǒng)。

4、幸運的是 : 本實驗室前期基于該系統(tǒng)的Cascade 和單一的 SviCas3 已在該菌株自身、大腸桿菌和釀酒酵母中實現(xiàn)了基因編輯。本論文旨在研究SviCas3 與谷氨酸棒狀桿菌間的生物相容性, 進而開發(fā)基于該菌株的基因編輯工具。實驗中 , 我們構(gòu)建了 2 個蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pEC-XK99E-cas753;pEC-XK99E-cas3中起始密碼子為ATG)和 3 個基因編輯質(zhì)粒(pXMJ19-t/g- ldh;pXMJ1 9-t/g-ldh:egfp;pXMJ19-t/g-ldh:cat),并通過兩步電轉(zhuǎn)化將蛋白表達(dá)質(zhì)粒和基因編輯質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至谷氨酸棒狀桿菌電轉(zhuǎn)感受中。驗證結(jié)果表明 :(1)

5、含有直接來源于維吉尼亞鏈霉菌IBL14 染色體中基因cas7、cas5 和 cas3 的蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEC-XK99E-cas753結(jié)合基因編輯質(zhì)?？沙晒Φ膶劝彼岚魻顥U菌進行基因組編輯( 乳酸脫氫酶基因內(nèi)部敲除了615 bp) 。(2) 僅含直接來源于維吉尼亞鏈霉菌 IBL14 染色體中單一 cas3 基因的蛋白表達(dá)質(zhì)粒 pEC-XK99E-cas3結(jié)合基因編輯質(zhì)粒也能成功的對谷氨酸棒狀桿菌進行基因組編輯 ( 成功的將 egfp 、 cat 基因插入到乳酸脫氫酶內(nèi)部 ) 。 (3) 脫靶分析研究中未發(fā)現(xiàn)脫靶事件。(4) 基于 Cas9 構(gòu)建的、作為對照試驗的基因編輯中沒有得到谷氨酸棒狀桿菌的轉(zhuǎn)化子?？傊?: 本論文 (1) 首次證實直接源于I-B-Svi型 CRISPR-Cas系統(tǒng)中Svicas7-5-3基因的所開發(fā)的編輯工具能對該菌株進行基因組編輯, 表明原核微生物中基因的堿基偏好要求不嚴(yán);(2) 首次證實了單一的未優(yōu)化的SviCas3 可對谷氨酸棒狀桿菌的基因組進行編輯, 表明在谷氨酸棒狀桿菌中Svi