PKM2對谷氨酰胺代謝和線粒體損傷的調控機制及白藜蘆醇的干預作用

1、PKM2對谷氨酰胺代謝和線粒體損傷的調控機制及白藜蘆醇的干預作用為應對缺氧和低營養(yǎng)條件的腫瘤微環(huán)境, 腫瘤細胞往往發(fā)生能量代謝的改變,即“代謝重編程”。主要表現(xiàn)在兩個方面 : 有氧糖酵解和對谷氨酰胺的高度依賴。腫瘤細胞通過代謝重塑為其生物合成提供大量的中間代謝產(chǎn)物, 表明代謝重編程在腫瘤惡性轉化過程中舉足輕重的作用。腫瘤細胞的葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝途徑均受到復雜的信號轉導途徑的調控, 因此探討這兩種代謝途徑間的調控關系及其產(chǎn)生原因 , 將為以腫瘤代謝為靶點的腫瘤治療提供理論基礎。近年來 , 隨著人們對腫瘤細胞能量代謝重塑的深入研究, 發(fā)現(xiàn) M2型丙酮酸激酶 (M2 type pyruvate

2、 kinase,PKM2)在糖酵解過程中扮演著關鍵角色。PKM2是糖酵解途徑中將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉化成為丙酮酸和ATP的限速酶。已知 PKM2在腫瘤細胞中特異性高表達, 在協(xié)調腫瘤細胞葡萄糖相關代謝途徑 ( 包括糖酵解、磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑 ) 中發(fā)揮關鍵作用 , 但 PKM2是否參與谷氨酰胺代謝及線粒體功能調控卻鮮為人知。本研究探討了 PKM2與谷氨酰胺代謝及線粒體功能調控之間的關系 , 并對其分子機制進行深入研究 , 為以代謝為靶點的腫瘤治療提供新思路 ; 進一步以 PKM2作為腫瘤治療的靶點 , 探討了白藜蘆醇對 PKM2的干預作用及分子機制 , 同時拓展了白藜蘆醇的藥用價

3、值。本研究獲得的主要研究結果如下 :(1) 探討 PKM2與谷氨酰胺代謝之間的關系及其分子機制。研究結果表明 ,PKM2穩(wěn)定敲低能夠增加谷氨酰胺酶 Gls1 、Gls2,谷氨酰胺轉運受體SLC1A5及其上游轉錄因子 -catenin 、c-Myc 的表達 , 而 PKM2過表達可抑制其表達 , 表明 -catenin/c-Myc信號通路介導 PKM2對谷氨酰胺代謝的調控。放線菌素 D實驗顯示 ,PKM2上調 -catenin的表達主要是通過調控其轉錄水平 , 而不是通過抑制 mRNA降解。檢測 PKM2不同點突變細胞株中 -catenin 的表達 , 發(fā)現(xiàn) R399E突變細胞能明顯抑制 -ca

4、tenin 的表達 , 即二聚體形式的 PKM2發(fā)揮關鍵作用。PKM2過表達上調 miR-200a 的表達 ,miR-200a 可與 -catenin 的 3 UTR結合抑制 -catenin 的表達。 (2) 探討 PKM2與線粒體功能之間的關系。采用線粒體探針標記 PKM2過表達及敲低的細胞中的線粒體 , 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) PKM2過表達的細胞中線粒體圍繞細胞核分布 , 融合線粒體的比例升高 , 線粒體數(shù)量減少。而 PKM2敲低后 , 線粒體分裂為更小的單位 , 數(shù)量增多。qPCR和 western blot 結果顯示 PKM2過表達后 , 線粒體分裂蛋白 Drp1 表達減少 , 融合蛋白

5、Mfn2 表達升高 ;PKM2敲低后 ,Drp1 表達升高 ,Mfn2 表達降低 ; 同時 ,PKM2過表達導致 ATP生成量減少 , 線粒體 DNA拷貝數(shù)增加 , 電子傳遞鏈復合物的表達下降。 (3) 探討 PKM2通過 Drp1 調控線粒體動態(tài)平衡的分子機制。研究結果顯示 PKM2過表達能夠在蛋白水平抑制 p53 表達 ,PKM2敲低促進其表達 , 而對 p53mRNA水平?jīng)]有影響。采用 p53 siRNA 處理細胞后 ,Drp1 隨 p53 表達的下降而下降 , 表明 PKM2能夠通過 p53 調控 Drp1 的表達。蛋白穩(wěn)定性實驗提示 ,PKM2過表達促進了p53 通過蛋白酶體途徑降解

6、 , 而PKM2敲低可增加 p53 蛋白的穩(wěn)定性 , 該過程是通過 MDM2介導的 p53 泛素化實現(xiàn)的。免疫共沉淀及GST pull-down 實驗表明 ,PKM2與 p53、 MDM2存在相互作用 ,推測 PKM2與 MDM2可結合到 p53 不同的結構域形成三元復合物促進p53 的泛素化 ,進而通過蛋白酶體途徑被降解。免疫組化檢測宮頸癌病人臨床樣本中PKM2和 Drp1 的表達 , 結果顯示 PKM2與 Drp1 的表達呈負相關 , 這與細胞水平得到的結果是一致的。 (4) 探討 PKM2通過Mfn2 調控線粒體動態(tài)平衡的分子機制。研究表明 PKM2過表達能夠抑制miR-106b 的表達

7、。雙熒光素酶報告實驗顯示miR-106b 可以直接靶向 Mfn2 3 UTR,進而抑制 Mfn2 的表達。采用 miR-106b 模擬物轉染細胞后 , 發(fā)現(xiàn) Mfn2的表達水平顯著降低 , 融合線粒體的數(shù)量及 mtDNA拷貝數(shù)減少 ,ATP 生成量升高。免疫組化檢測乳腺癌病人臨床樣本中 PKM2和 Mfn2 的表達 , 結果顯示 PKM2與 Mfn2 的表達呈正相關 , 這與細胞中所得結果是一致的。(5) 探討白藜蘆醇對 PKM2的干預作用及分子機制。 研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過靶向抑制 PKM2的表達發(fā)揮其抗腫瘤活性。白藜蘆醇處理后導致線粒體分裂成更小、 更多的線粒體 , 且 Drp1 和 F

8、is 表達明顯升高 ,Mfn2 的表達顯著下降 ,PKM2過表達可逆轉這一現(xiàn)象 ; 另外 , 內質網(wǎng)應激的關鍵分子 GRP78、CHOP和 Caspase12顯著上升 ,PKM2過表達后其表達明顯逆轉。檢測 PKM2敲低的穩(wěn)定細胞株中上述指標的表達 , 發(fā)現(xiàn)內質網(wǎng)應激指標及線粒體分裂蛋白表達上調 , 線粒體融合蛋白表達下降。以上結果表明 PKM2介導的內質網(wǎng)應激和線粒體分裂參與白藜蘆醇誘導的細胞凋亡。雙熒光素酶報告實驗顯示 miR-326 可直接與 PKM2的 3UTR結合 , 進一步實驗結果表明白藜蘆醇能夠通過上調miR-326 有效抑制 PKM2的表達。綜上所述 :PKM2缺失可通過激活 -catenin/c-Myc信號通路促使谷氨酰胺代謝發(fā)揮代償作用。 PKM2一方面通過 p53/Drp1 軸抑制線粒體分裂 , 另一方面通過 miR-106b/Mfn2 軸促進線粒體融合 , 最終引起線粒體過度融合、功能受阻。白藜蘆醇可通過上調miR-3