TA29-Barnase轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜的獲得及豌豆花藥特異啟動(dòng)子PsEND1功能分析載體構(gòu)建

1、TA29-Barnase 轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜的獲得及豌豆花藥特異啟動(dòng)子 PsEND1功能分析載體構(gòu)建雄性不育作為雜種一代生產(chǎn)最為經(jīng)濟(jì)、有效的方法在水稻、 玉米、油菜以及部分蔬菜作物中廣泛應(yīng)用。 由于具有育種實(shí)用價(jià)值的天然雄性不育資源較為稀缺,同時(shí)不育資源在不同作物中分布不均勻, 導(dǎo)致一些農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用發(fā)展緩慢。針對(duì)該情況 , 育種家將解決問(wèn)題的思路轉(zhuǎn)向通過(guò)基因工程創(chuàng)制雄性不育。目前 , 利用基因工程手段己經(jīng)在多種植物中獲得了雄性不育系, 并在油菜、玉米、菊苣等作物中成功商業(yè)化應(yīng)用。芥菜是我國(guó)的特產(chǎn)蔬菜之一, 雖然近年來(lái)利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育在芥菜雜種優(yōu)勢(shì)育種上取得了一定的進(jìn)展, 但如何發(fā)掘、創(chuàng)

2、造優(yōu)良的芥菜雄性不育材料仍是當(dāng)前芥菜雄性不育研究的重要內(nèi)容之一。同時(shí), 為保證基因工程雄性不育系育性穩(wěn)定性, 獲得一個(gè)時(shí)空表達(dá)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)男坌云鞴偬禺悊?dòng)子是關(guān)鍵要素之一。PsEND1啟動(dòng)子 (Pisum sativum ENDOTHECIUM1)是一個(gè)長(zhǎng)度為2.7Kb 的豌豆花藥特異啟動(dòng)子 , 該啟動(dòng)子早期在花藥原基細(xì)胞表達(dá), 之后便嚴(yán)格限制在雄蕊原基的表皮、結(jié)締組織、藥室內(nèi)壁和中層細(xì)胞等細(xì)胞層表達(dá)。相對(duì)基因工程雄性不育常用的絨氈層啟動(dòng)子 , 該啟動(dòng)子在花藥發(fā)育的開(kāi)始驅(qū)動(dòng)不育基因的表達(dá), 在小孢子母細(xì)胞分化之前阻止小孢子的發(fā)生, 最終導(dǎo)致花粉敗育。 因此 , 該啟動(dòng)子控制的雄性不育可能敗育更為徹底

3、。但目前 , 有關(guān)該啟動(dòng)子的功能區(qū)域尚未有研究報(bào)道, 同時(shí)該啟動(dòng)子序列太長(zhǎng)也不利于雄性不育基因的遺傳操作。針對(duì)上述情況, 本論文將煙草絨氈層TA29啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的Barnase 基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入“渝豐”榨菜, 獲得了敗育徹底的雄性不育植株 , 拓寬芥菜雄性不育資源。 同時(shí) , 根據(jù)啟動(dòng)子的順式作用元件的分布情況設(shè)計(jì)引物 , 對(duì)全長(zhǎng) 2.7Kb 的 PsENDl啟動(dòng)子進(jìn)行 5端缺失 , 分別與 GUS報(bào)告基因和 Barnase 基因構(gòu)建融合表達(dá)載體 , 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105,并分別轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草 , 獲得的主要結(jié)果如下： 1. TA29-Barnase 轉(zhuǎn)基因雄性不育芥菜植株的獲得

4、 (1) 將 TA29-Barnase 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化“渝豐”榨菜下胚軸, 通過(guò)PPT(phosphinothricin,膦絲菌素 ) 的多輪篩選獲得轉(zhuǎn)基因芥菜植株。(2) TA29-Barnase 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的分子檢測(cè)提取轉(zhuǎn)基因植株 DNA用TA29-1+BN-2引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 , 結(jié)果在 5 株轉(zhuǎn)基因植株中擴(kuò)增出預(yù)期約630bp大小的 DNA片段 , 表明外源目的基因已整合到芥菜植物基因組中。(3) 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的花器官形態(tài)轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型芥菜植株形態(tài)之間無(wú)明顯差異, 但開(kāi)花時(shí)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比花朵偏小, 并伴隨花瓣較小、雌蕊短且粗、雄蕊短縮的現(xiàn)象 , 同時(shí)花藥

5、瘦小、 干癟、無(wú)花粉囊及花粉。 (4) 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察通過(guò)石蠟切片和顯微觀察, 轉(zhuǎn)基因植株的花藥絨氈層細(xì)胞提前降解 , 不能產(chǎn)生有活性的花粉 , 花藥敗育。(5) 轉(zhuǎn)基因芥菜植株的結(jié)實(shí)性轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花后 , 自交花朵的果莢基本不能膨大 , 部分脫落 , 無(wú)種子形成 , 用野生型植株花粉授粉后 , 基本均能結(jié)實(shí) , 但與野生型植株相比果莢較短 , 不飽滿 , 且種子數(shù)少。 2. PsENDl啟動(dòng)子的功能分析載體構(gòu)建 (1) 提取豌豆 DNA,利用引物 PSE1+PSE2擴(kuò)增獲得預(yù)期長(zhǎng)度為 2.7Kb 的 PsEND1啟動(dòng)子 , 測(cè)序分析顯示獲得了正確的PsEND1啟動(dòng)子。(

6、2) 對(duì) PsEND1啟動(dòng)子進(jìn)行 5端缺失 ,PCR獲得五條不同長(zhǎng)度的5端缺失啟動(dòng)子。分別以 PS-2+PS-7; PS-3+PS-7; PS-4+PS-7; PS-5+PS-7; PS-6+PS-7為引物 ,PsENDl 為模板 ,pfu高保真酶擴(kuò)增出5 個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段, 將擴(kuò)增出預(yù)期目的片斷插入PSK,測(cè)序結(jié)果正確 , 依次命名為 PSKPS、PSKPS-3、PSKPS-4PSKPS、-5PSKPS-6。 (3) 不同長(zhǎng)度 PsENDl5端缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Barnase基因表達(dá)載體的構(gòu)建以BN-F+BR-R為引物 ,PCABARABN-10為模板 ,pfu 高保真酶擴(kuò)增 Barnas

7、e 及下游的 Nos 終止子和 Bastar 基因 ,PCR產(chǎn)物用 NcoI+EcoRI 酶切后插入中間載體 PB1525后進(jìn)行測(cè)序分析。將 PSKPS-2(3、4、5、6) 上的不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子酶切下來(lái)替換中間載體上的 35S-35S 啟動(dòng)子 , 最后將構(gòu)好的不同長(zhǎng)度的PsENDl缺失啟動(dòng)子及下游的Barnase 基因片段用 Hind+EcoRI 酶切后插入PCABarSN/SCG載體相應(yīng)位點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)的植物表達(dá)載體PCABarPS-2Barnase、PCABarPS-3Barnase、 PCABarPS-4Barnases、 PCABarPS-5Barnase、PCABarPS-6Barnase。上述載體經(jīng) PCR、酶切檢測(cè)正確 , 用液氮凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。(4) 不同長(zhǎng)度 PsENDl5端缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建將PBIIN2-1/GUS載體中的 GUS基因及下游的 Nos終止子用 Ncol+EcoR1替換上述載體中的Barnase基因 , 獲得 PCABarPS-2Gus、PCABarPS-3Gus、PCABarPS-4Gus、 PCABarPS-5Gus、PCABarPS-6Gus表達(dá)載體。上述載體經(jīng) PCR、酶切檢測(cè)均正確 , 用液氮凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 EHA105。(5) 將 P