細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)操作程序

1、標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序編號(hào)：S0P-QM-243-B頁(yè)碼：1/9制定人：審核人：批準(zhǔn)人：頒發(fā)部門：日期：日期：日期：生效日期：分發(fā)部門：品質(zhì)部、中心化驗(yàn)室、過程分析室LI的：規(guī)范細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)操作程序。范圍：適用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查操作。責(zé)任：品質(zhì)部組織制定，中心化驗(yàn)室負(fù)責(zé)實(shí)施。內(nèi)容1準(zhǔn)備工作實(shí)驗(yàn)設(shè)備及用具1.1.1 刻度吸管、稱量瓶、銀子、安瓶瓶（2ml、5M）x藥匙、250烘烤1小時(shí)。1.1.2 干燥箱、恒溫水浴鍋、漩渦混合器、精密天平。1.1.3 剪刀、砂輪片、醫(yī)用膠布、洗耳球、試管架、脫脂棉球、水銀溫度汁、試管內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)驗(yàn)試劑1.2.1堂試劑：在使用前應(yīng)進(jìn)行靈敏度測(cè)定，原則上購(gòu)

2、進(jìn)一個(gè)批號(hào)測(cè)定一次。1.2.2細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量mL滅菌注射用水）。1.2.3細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品和工作標(biāo)準(zhǔn)品。75%乙醇、輅酸洗液。實(shí)驗(yàn)用具的消毒處理：凡是參與實(shí)驗(yàn)樣品或試劑接觸的器具，在實(shí)驗(yàn)前必須經(jīng)除細(xì)菌內(nèi)毒素處理，將洗凈的器具經(jīng)純化水沖洗后，在250干熱滅菌至少60分鐘。恒溫水浴箱內(nèi)水浴溫度調(diào)節(jié)到37±1o2鯊試劑靈敏度復(fù)核根據(jù)登試劑靈墩度的標(biāo)示值（如：.X=EU/ml）,細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品加入1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在漩渦混合器上混勻15分鐘。將工作標(biāo)準(zhǔn)品制備成2人、入、入、入四個(gè)濃度（EU/mlsEU/ml、EU/mi、EU/ml）的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用

3、。山東天力藥業(yè)有限公司標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序編號(hào):SOP-QM-243-B頁(yè)碼：2/9例：工作標(biāo)準(zhǔn)品為160EU/ml時(shí)160EUini6EU/ml.8EU.ini.1EU/in!iniml標(biāo)準(zhǔn)品溶液fmlml注惠.土禹釋一步均應(yīng)孔3I忌上混勻30秒。取18支EU/ml試劑，每支中加入水，然后分別加入中制備好的4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，按濃度從高到低依次加入，每個(gè)濃度加4支，；最后2支加入水作陰性對(duì)照。將上述試管用醫(yī)用膠布封口，垂直放入37°C±rC水浴鍋中，保溫60±2分鐘。放入水浴前把水?dāng)噭?dòng)兒下，以使水溫均勻。再次檢查溫度是否在所要求的范圍，注意保溫和取放過程應(yīng)

4、避免受到振動(dòng)造成的假陰性結(jié)果。保溫結(jié)束后將試管輕輕取出，緩緩轉(zhuǎn)到180。，若關(guān)內(nèi)形成凝膠，不變形、不從管壁滑落者為陽(yáng)性；未形成凝膠或形成凝膠變形從壁滑落者為陰性。（注意：保溫盒拿取試管過程應(yīng)避免受到震動(dòng)而造成的假陰性結(jié)果）結(jié)果判定當(dāng)最大濃度2人4支管均為陽(yáng)性，最低濃度人4支管均為陰性，陰性對(duì)照2支管為陰性，實(shí)驗(yàn)方有效。如圖12 AX0.5J J o o o o © o人。0.25人勰J J o o o o山東天力藥業(yè)有限公司標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序編號(hào):SOP-QM-243-B頁(yè)碼：3/9按下述公式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的兒何平均值，即為強(qiáng)試劑靈敬度的測(cè)定值xco當(dāng)Ac在X-2X時(shí)，方

5、可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，并以標(biāo)示靈敬度人為該批鯊試劑的靈敬度。Xc 二 antilg（工式中：X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值1g。反應(yīng)重點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。anti1g是1g函數(shù)的反函數(shù)，在excel里可以用power公式，power(數(shù)值)舉例設(shè)待復(fù)核強(qiáng)試劑的靈敬度為EU/ml,即EU/mlo實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：內(nèi)毒素濃度(EU/ml)Nc反應(yīng)終點(diǎn)濃度X1+山東天力藥業(yè)有限公司標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序編號(hào):SOP-QM-243-B頁(yè)碼：4/9則：入c=antilg(EX/4)=antilg(+)/4=antiIgtantilg=(EU/ml)Ac在X-2X范圍內(nèi)

6、，符合規(guī)定。結(jié)果不是內(nèi)毒素最大濃度(2X)4管全部陽(yáng)性，最小濃度(人)4管全部陰性，本批鯊試劑不能使用。需查找原因，可能是靈敏度標(biāo)示不準(zhǔn)確或內(nèi)毒素效價(jià)標(biāo)示不準(zhǔn)確，或操作不當(dāng)所致。3.干擾實(shí)驗(yàn)干擾試驗(yàn)的口的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對(duì)內(nèi)毒素和登試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即入、X、入、才。制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將中的同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個(gè)濃度即X、入、X、入的含內(nèi)毒素的供試品溶液。強(qiáng)試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格

7、為支的強(qiáng)試劑36支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核生:試劑的規(guī)格不是支時(shí)，按其標(biāo)示量加入檢查用水復(fù)溶，將復(fù)溶后的強(qiáng)試劑帑液混和在一起,然后每分裝到10X75nlm凝集管中，要求至少分裝36管備用。凝膠反應(yīng)山東天力藥業(yè)有限公司標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序|編號(hào)：S0PQM-243B|頁(yè)碼：5/9將準(zhǔn)備好的鯊試劑18支（管）放在試管架上，排成5歹II，4歹IJ4支（管人1歹IJ2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入的入、入、入、入的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，另一

8、列2支（管）加入檢查用水作為陰性對(duì)照。將另外18支（管）宿:試劑放在試管架上，排成5歹U，4歹U4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入的X、入、X、X的內(nèi)毒素的含供試品溶液；另一列2支（管）加入供試品溶液作為樣品陰性對(duì)照，如表1所示。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，兩同試管架放入37°c±rc水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。表1凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液2B2X/供試品溶液供試品溶液1242IX44X48X4C2

9、人/檢查用水檢查用水12X421X44X48X4D無(wú)/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為干擾試劑系列；C強(qiáng)試劑標(biāo)示靈敬度的對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照。山東天力藥業(yè)有限公司標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序編號(hào):SOP-QM-243-B頁(yè)碼:6/9判定并計(jì)算C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的集合平均值（Es和Et）只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鯊試劑靈敬度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算系列溶液C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的兒何平均值（Es和Et）:Es=anti1g（EXs/4）Et=antilg（LXt/4）式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g

10、）。當(dāng)Es在入2X（包括X和2X）及Et在2Es（包括和2Es）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)?？赏ㄟ^對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品洛液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)鯊試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化

11、時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。3供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠限度試驗(yàn)要求：在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品和2支供試品陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)每次試驗(yàn)必須做2支陽(yáng)性對(duì)照和2支陰性對(duì)照。4.1.1因藥典對(duì)甘露醇原料藥內(nèi)毒素?zé)o要求，參照甘露醇注射液內(nèi)毒素限值，每1g甘露醇中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于。根據(jù)MVD二CL/入，且當(dāng)供試品為注射用原料藥時(shí)，MVD取1。故20%甘露醇注射液的工試劑限度為：Xmixg二ml操作方法4. 2.1供試品溶液的制備標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序編號(hào)：SOP-QM-243-B頁(yè)碼:7/9準(zhǔn)確稱取I寸露醇用E1BET水落解，制成20%H-露醇溶液。根據(jù)MVD二CL/X,將供試品進(jìn)行稀

12、釋，其稀釋倍數(shù)不得超過MVD。式中：C為供試品濃度。L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。X為在凝膠法中登試劑的標(biāo)示靈敬度。例：當(dāng)用標(biāo)示值為ml靈敏度的黨:試劑時(shí)，MVD二CL/A-20%X二1（倍），所以把供試品制成20%的稀釋液即可。 當(dāng)用標(biāo)示值為ml靈敬度的強(qiáng)試劑時(shí)，MVD二CL/X二20%X二2（倍），所以把供試品制成10%的稀釋液即可。 當(dāng)用標(biāo)示值為ml靈墩度的強(qiáng)試劑時(shí)，MVD二CL/人二20%X二4（倍），所以把供試品制成5%的稀釋液即可。陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2X濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取規(guī)格為10EU的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品一支用酒精棉球?qū)⑵款i消毒后開啟，加BET檢查

13、用水混合15分鐘后備用。例：當(dāng)用標(biāo)示值為ml靈敬度的強(qiáng)試劑時(shí)，2A二ml,（10EU/inl標(biāo)準(zhǔn)品溶液）ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液）1OEU/mlA1. OEU/mlml標(biāo)準(zhǔn)品溶液例：當(dāng)用標(biāo)示值為ml靈敬度的登試劑時(shí)，2X=ml,（lOEU/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液）ill標(biāo)準(zhǔn)品溶液）ml標(biāo)準(zhǔn)品涪液）10EU/inl>1.OEV/mlini標(biāo)準(zhǔn)品溶液山東天力藥業(yè)有限公司標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序I編號(hào)：S0P-QL243-BI頁(yè)碼：8/9供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用待檢測(cè)的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2X濃度的內(nèi)毒素溶液。例：當(dāng)用標(biāo)示值為ml靈敬度的蚩試劑時(shí),2X=ml,vlOEU/nl標(biāo)HE品涪液

14、ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液）1OEU/mlml供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液l.OEU/inl標(biāo)準(zhǔn)品溶液,（20%供試品溶液）（20%供試品溶液）例：當(dāng)用標(biāo)示值為ml靈墩度的強(qiáng)試劑時(shí)，2人二ml,（lOEU/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液）nil標(biāo)準(zhǔn)品溶液）ml標(biāo)準(zhǔn)品涪液）標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10%供試品溶液）（10%供試品溶液）（10米供試品涪液）si iRiAnn陽(yáng)桂加昭溶游陰性對(duì)照液即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水4.5.1鯊試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為的登試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后開啟備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入檢查用水溶解。4.5.2加樣取8支2.2.5溶解好的鯊試劑，其中2支加入供試品溶液，作為供試品管；2支加入陽(yáng)性對(duì)照溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照管（PC）；2支加入供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液，作為供試品陽(yáng)性對(duì)照管（PPC）；2支加入檢查用水作為陰性對(duì)照管（NC）。試驗(yàn)加樣如：（單位ml）參照管試劑'供試品管陽(yáng)性對(duì)照PC供試品陽(yáng)性對(duì)照PPC陰性對(duì)照NC12121212化:試劑山東天力藥業(yè)有限公司標(biāo)題：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作程序編號(hào):SOP-QM-243-B頁(yè)碼9/9供試品液BET用水供試品陽(yáng)性對(duì)照液陽(yáng)性對(duì)照液4.5.3將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37°C