產γ-氨基丁酸菌株的篩選與發(fā)酵

1、產-氨基丁酸菌株的篩選與發(fā)酵1. 實驗目的（1）學習運用代謝控制發(fā)酵理論設計篩選產-氨基丁酸菌株的方法。（2）對5L發(fā)酵罐的使用方法有初步了解。2. 實驗原理-氨基丁酸在茶葉、米胚芽等植物細胞中含量較多，可直接提取制備?；蛘呃么竽c桿菌，霉菌和乳酸菌等微生物細胞生產-氨基丁酸也同樣可以達到很高的產量。在微生物細胞中，一分子谷氨酸（L-Glu）在有一個H+存在的條件下脫去-羧基得到一分子-氨基丁酸和一分子CO2（L-Glu+ H+GABA+CO2），催化反應的酶是谷氨酸脫羧酶（EC .15， GAD）。谷氨酸脫羧酶是GABA合成過程中的唯一關鍵限速酶，最適pH在4-6之間，底物谷氨酸對它有激活作

2、用。在反應過程中隨著H+的消耗，培養(yǎng)基pH會逐漸升高，當pH大于6.8時，能夠使溴甲酚紫由黃變紫。還原糖可作為微生物生長發(fā)育的碳源和能量來源，pH是調控GAD活性的關鍵因素，OD600可以用來衡量菌體量的多少，L-Glu和GABA的濃度變化直接反映出底物轉化率和產量。因此，在5L發(fā)酵罐的發(fā)酵試驗中，需要對以上幾個因素進行檢測，以便為優(yōu)化發(fā)酵條件提供試驗依據。3. 實驗材料（1） 酸菜湯：來自于市售酸菜或家庭自制的東北酸菜。（2） 培養(yǎng)基 初篩培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫 0.2%， L-Glu 3%（可用同物質的量的谷氨酸鈉代替）和瓊脂粉 2%，pH5.0，121滅菌20min。溴甲酚

3、紫用過濾器除菌。種子培養(yǎng)基：液體MRS培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：在液體MRS培養(yǎng)基中加入3%的L-Glu（可用同物質的量的谷氨酸鈉代替），pH5.0。L-Glu可用110滅菌10min，以減少高溫高壓條件下的損失。（3）儀器及其他用具 5L發(fā)酵罐，紫外分光光度計，高效液相色譜儀，層析缸，培養(yǎng)皿，錐形瓶，試管，pH計等。4. 實驗步驟及方法（1）以無菌操作，用移液管取酸菜湯汁1mL吹于裝有9mL生理鹽水的試管中，充分振蕩搖勻，再從這支試管中取1mL吹于下一支裝有9mL生理鹽水的試管中，充分震蕩搖勻。如此往復，將酸菜湯汁稀釋10-10-10-14倍。取稀釋后的湯汁0.1mL涂布在初篩平板培養(yǎng)基上，30，

4、培養(yǎng)36-48h。（2）挑取在初篩培養(yǎng)基上長出的，菌落周圍培養(yǎng)基變成紫色的單菌落，轉接于300mL種子培養(yǎng)基中，30靜置培養(yǎng)14-16h。（3）取30mL種子培養(yǎng)液轉接于另一瓶300mL種子培養(yǎng)基中，30靜置培養(yǎng)14-16h。（4）將300mL種子培養(yǎng)液接入3L無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，30靜置培養(yǎng)72h。在發(fā)酵過程期間采用自動流加HCl和NaOH的方式調節(jié)發(fā)酵液pH為5.0。以無菌操作，每隔6h取4mL發(fā)酵液于無菌試管中，測量OD600，并對pH進行記錄。（5）將取出的發(fā)酵液離心取上清，參考DNS測還原糖的方法1測定發(fā)酵液中葡萄糖的濃度，做記錄。（6）利用紙層析法測定L-Glu和GABA的濃度。展開

5、劑為正丁醇: 冰醋酸: 水=6: 1: 3 (V/V/V)。展開劑中含茚三酮（0.4%、W/V）。發(fā)酵液5000r/min離心后，取上清1L點樣，放入層析液中層析8h，90烘干20min。以硫酸銅（0.1%）：乙醇（75%）=1：19的洗脫劑將層析點上的顏色洗脫下來，520nm波長下測定吸光值。（7）還可用高效液相色譜儀測定L-Glu和GABA的濃度。取發(fā)酵液上清10L，加入衍生緩沖液100L、衍生劑2，4-二硝基氟苯100L，定容緩沖液790 L于1.5mL離心管中，混勻，60水浴1h。20l進樣。用KromasilC18柱，流速0.8mL/min, 360 nm檢測。流動相為乙腈、醋酸鈉溶

6、液和水，梯度洗脫（表1）。測定發(fā)酵液中L-Glu和GABA的濃度。表1 梯度洗脫程序TimeA（%）B（%）C（%）Flow(mL/min)010122333232323235444540.80.80.8注：A：水。B：乙腈。C：pH6.4 醋酸鈉溶液。（8）發(fā)酵結束后將發(fā)酵液從罐體中吸出，清洗發(fā)酵罐，清洗pH電極、溫度電極等，并對其進行正確的保養(yǎng)與儲存。（9）整理實驗記錄。5. 試驗數據處理OD600和pH直接從儀器上讀取。葡萄糖濃度的數據處理方法參照“DNS法測定葡萄糖的方法”。L-Glu和GABA的數據處理方法參考文獻產-氨基丁酸菌株的分離和選育2。6. 實驗報告實驗報告方法可參照下表：

7、Time/hOD600葡萄糖/%pHL-Glu/%GABA/%0005506.12.18.7. 結果與討論（1）結合發(fā)酵試驗數據分析該菌株是否有GAD活力。（2）仔細觀察初篩平板上的單菌落形態(tài)，做詳細記錄并拍照。（3）對種子培養(yǎng)液中的菌體進行革蘭氏染色試驗，用油鏡仔細觀察并拍照。（4）結合代謝控制發(fā)酵原理分析葡萄糖濃度和菌體量之間的關系。（5）分析pH、L-Glu和GABA之間的關系。計算產物含量和底物摩爾轉化率。（6）在優(yōu)化發(fā)酵條件控制方面提出展望，如是否補糖、是否補底物等。8. 參考文獻（1）袁道強，生物化學實驗和技術M，中國輕工業(yè)出版社，2006，2：126-127。（2）馮宇，張穎，潘超強等