植物高光效育種

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上植物高光效育種光合作用是決定作物產(chǎn)量最重要的因素之一，作物中90以上的干重直接來源于光合作用。因此，光合作用效率的高低直接關系到作物的產(chǎn)量。根據(jù)光合作用碳同化途經(jīng)中CO2固定的最初光合產(chǎn)物的不同，可把高等植物分成C3、C4和景天酸植物。C4植物是從C3植物進化而來的一種高光效種類。與C3植物相比，它具有在高光強、高溫及低CO2濃度下保持高光效的能力。而一些主要農(nóng)作物如水稻、小麥、馬鈴薯、甜菜等均為C3作物。通過提高農(nóng)作物的光合作用效率來提高產(chǎn)量水平，即高光效育種，一直是國際光合作用研究和作物育種等領域專家關注的熱點。 自20世紀60年代以來，人們一直試圖利用C4光合特

2、性來改進C3植物的光合效率。傳統(tǒng)的雜交育種手段至今尚未取得令人滿意的結果，其雜種F1和F2 代的光合效率均比任何一個親本都低。隨著生物技術的發(fā)展，為利用基因工程手段培育高光效作物提供了一條行之有效的途徑。本文就近年來該方面的研究進展作一綜述。 1 高光效基因工程育種的理論基礎 C3植物中，CO2的固定主要取決于1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)的活化狀態(tài),它催化 1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化，將大氣中的CO2同化，產(chǎn)生兩分子磷酸甘油酸，可見Rubisco在C3植物中同化C

3、O2的重要性。C4植物固定CO2的酶為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC),與C3作物中Rubisco相比，PEPC對CO2的親和力高。C4植物的細胞分化為葉肉細胞和鞘細胞，而光合酶在兩類細胞中的分布不同,如PEPC在葉肉細胞固定CO2，生成草酰乙酸(OAA),OAA進一步轉化為蘋果酸(Mal), Mal進入鞘細胞脫羧,被位于鞘細胞內的 Rubisco羧化,重新進入卡爾文循環(huán)。這種CO2的濃縮機理導致了鞘細胞內高濃度的CO2積累，一方面提高Rubisco的羧化能力，另一方面又大大抑制了Rubisco 的加氧活性,降低了光呼吸,從而使

4、C4植物保持高的光合效率。正是因為C4途徑具有高光合能力，以及C3植物中C4途徑的客觀存在，啟示了通過基因工程將C4 途徑的關鍵酶編碼基因導入C3植物的可能性，為利用基因工程手段培育高光效作物品種提供了理論依據(jù)。 2 高光效基因工程育種策略 2.1 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的修飾與改造 植物光合作用過程中最大的限制酶是Rubisco，它的反應速度每秒只有23次，與一般的酶促反應速度 (每秒25000次左右)相比，效率極低；Rubisco是一個雙功能酶，它不僅催化RuBP的羧化反應，而且還催化其加氧反應。加氧反應中除消耗能量外，還損失羧化反應中固定的2050的有機碳。

5、為提高作物中Rubisco同化CO2的效率，許多研究者希望通過改變酶的結構來改變其羧化/加氧的比值，從而提高作物的光合效率，但至今仍未獲得成功。自從Read和Tabita (1994)發(fā)現(xiàn)在硅藻和紅藻中存在的Rubisco具有比高等植物高得多的效率后，Uemura等又發(fā)現(xiàn)了一種嗜熱紅藻的Rubisco羧化效率約是高等植物的2.53 倍。更高效率的Rubisco在紅藻中的發(fā)現(xiàn)，給修飾改造 Rubisco的長期努力提供了新的動力和希望。Whitney 等通過質體轉化的方法將紅藻高效率Rubisco的小亞基編碼基因引入煙草的葉綠體中得到了高效表達，但是表達的小亞基卻不能與煙草本身的大亞基組裝成全酶。

6、酶的組裝是一個十分復雜的過程，還有待于進行深入研究。 2.2 C3光合途徑關鍵酶基因的克隆與轉化 C4光合途徑主要涉及3種關鍵酶，即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸丙酮酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK)和依賴于NAD(P)的蘋果酸酶NAD(P)-dependent malic enzyme，NAD(P)-ME。 目前，C4途徑的3種關鍵酶基因均已從不同的C4 植物中克隆出來并分別導入不同的C3植物中。C4型 PEPC基因的cDNA是首先從玉米和黃花菊屬植物 Flaveria trinervia中克隆出來的(Izui等，1986；Poe

7、tseh 等1991)。玉米C4型PEPC基因全長約6.8kb，結構基因由10個外顯子和9個內含子組成；其cDNA長度為2.91kb，編碼970個氨基酸殘基，其蛋白質分子量為 109.4kDa。玉米PPDK基因全長約12kb，有19個外顯子，其中第一外顯子編碼轉運肽，第一內含子由于包含細胞質型PPDK的啟動子，長達5.9kb；其mRNA 編碼947個氨基酸殘基，前體蛋白質分子量為 102.7kDa，其中N端71個氨基酸殘基是轉運肽，成熟蛋白包含876個殘基。玉米NADP-ME的cDNA全長2184 bp，編碼636個氨基酸殘基，前體蛋白分子量為 69.8 kDa。 Hudspeth等將玉米PE

8、PC的cDNA與煙草Cab (chlorophyll la/b binding protein，編碼光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的捕光葉綠素結合蛋白的基因家族)基因的啟動子和終止子重組在一起并轉到煙草中，轉基因植株 PEPC的活性比對照高2倍。Gehlin等將由 CaMV35S (cauliflower mosaic virus 35S gene，煙草花葉病毒35S基因)啟動子調控的Corynibacterium glutanicum、E.coli和Flaveria trinervia的PEPC基因導入馬鈴薯，獲得了PEPC活性提高212倍的轉基因植株。Ishimaru等將擬南芥RbcS(rubisc

9、o small subunit，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基基因)啟動子和CaMV35S啟動子調控的玉米PPDK基因導入擬南芥中，轉基因植株的PPDK活性為對照的4 倍。他們還將玉米的PPDK基因轉入馬鈴薯中，轉基因植株的PPDK活性比對照高5.4倍。Takeuehi 等將CaMV35S啟動子調控的玉米NADP-ME基因 cDNA導入水稻，Tsuchida等將水稻Cab啟動子調控的玉米NADP-ME基因cDNA導入水稻，雖然獲得了酶活顯著提高的轉化苗，但在自然光下，轉基因植株的葉片白化，生長受到明顯抑制。 將C4光合途徑關鍵酶基因的cDNA轉入C3作物中已有許多成功報道，但所獲得的

10、轉基因植株的相關酶活遠遠低于C4植物，而全長基因的導入，顯著提高了轉基因植株的酶活。Ku等將玉米PEPC的全長基因(包括外顯子、內含子及自身的啟動子)用農(nóng)桿菌介導法導入水稻，獲得了高水平表達玉米PEPC的轉基因植株；在一些轉基因植株中，PEPC的活性甚至比玉米中的高23倍，達到葉片可溶性蛋白的12。同對照相比，轉基因植株顯著減少了氧氣對光合的抑制作用。繼Lepiniec等(1992)從高粱中克隆出PEPC全長基因后，張方等從不同的高粱品種中克隆出一種新型的PEPC基因，并將之導人水稻中，獲得了PEPC活性較對照高26倍的轉基因植株。陳緒清等采用 LA-PCR方法從玉米中克隆出全長PEPC基因，

11、并將其導入小麥。通過對轉基因小麥葉片中PEPC酶活性的初步測定，發(fā)現(xiàn)部分轉基因植株葉片中PEPC酶活性提高了35倍，與玉米葉片中的PEPC酶活性相當。 Fukayama等將玉米PPDK全長基因及不同啟動子調控的cDNA分別導入水稻，結果表明，轉全長基因的水稻PPDK活性比非轉基因水稻高40倍，而轉cDNA 的水稻PPDK的活性僅為對照的5倍。 3 高光效基因工程育種進展中存在的問題 C4關鍵酶基因向C3作物的成功導入及其在C3作物中高效表達，說明利用基因工程手段培育高光效作物品種的可行性，但仍有許多問題需要進行深入系統(tǒng)的研究。 3.1 PEPC基因的轉化 雖然許多轉基因植株PEPC的酶活與未轉

12、基因植株相比顯著提高，但光合效率并未提高。如Ku等得到的轉基因水稻，其PEPC活力甚至是玉米的23 倍，但是除了其抗氧抑制的能力有所增強外，并未發(fā)現(xiàn)光合效率有所提高。轉基因植物中PEPC活力的提高，勢必使其作用的產(chǎn)物草酰乙酸(OAA)的濃度升高；如果生成的OAA不能迅速脫羧或被轉運掉，其 PEPC活力就會被OAA強烈抑制，因而就難以實質性地啟動單細胞內的四碳雙羧酸微循環(huán)而有效提高轉基因作物中四碳雙羧酸濃度，以致最終不能有效地提高光合效率。 3.2 脫羧酶基因的轉化 由于C3植物中PEPC基因的轉入未能有效地提高轉基因作物的光合效率，因此，人們又將C4循環(huán)中與脫羧相關的酶基因導人C3作物中，如磷

13、酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenopyruvate carboxykinase，PEPCK) 和NADP-ME。由于PEPCK是細胞質型的酶，若將其轉到細胞質中，其脫羧反應發(fā)生在細胞質中，因而使得四碳雙羧酸僅在細胞質中進行無效循環(huán)，并不能提高葉綠體內的CO2濃度，從而也難以提高Rubisco的效率。因此，人們開始嘗試把脫羧相關酶基因轉到葉綠體中。 Hausler等將來自于F.pringlei的NADP-ME或S. meliloti的PEPCK基因連同來自C.glutamicum的 PEPC基因一同導人煙草中，結果對植物的光合表現(xiàn)并未產(chǎn)生實質性的影響。Lipka等報道，將PEPC基因和N

14、ADP-ME基因分別轉入細胞質和葉綠體中，結果除了能在高光強、高溫下對同化CO2的電子需求有所降低外，其光合作用效率依然沒有改善。 3.3 葉綠體內磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的再生 將PEPC和NADP-ME基因引入C3植物，都未能有效地改善C3植物光合作用，因而人們又將注意力放在轉基因植物中葉綠體內PEP再生問題上。PPDK催化葉綠體內PEP的生成。Ku等報道，過量表達 PEPC和PPDK的轉基因水稻的光合能力和產(chǎn)量分別增加35和22，這種結果有可能是由于PPDK基因的導入增加了葉綠體中PEP的含量所致，當然，這只是一種猜想，還需進一步的試驗證明。 3.4 葉綠體中PEP的輸出 將葉綠體中由

15、PPDK或PEPCK催化形成的PEP 有效地轉運出去是在C3植物中運行C4循環(huán)的一個前提條件。C3植物中計綠體型的PEP轉運器 (phosphoenolpyruvate/phosphate translocator，PPT)僅有很低的活性，勢必成為四碳雙羧酸循環(huán)的一個限制因素。據(jù)Hiiusler等引自UI Fliigge實驗室未發(fā)表資料表明，來自花椰菜芽的PFF基因在CaMV35S啟動子調控下導入煙草，轉化體中PEP轉運速度同野生型相比提高了10倍。但目前對PPT活性的調節(jié)因素、 PPT基因的表達、調控方式以及它在植物代謝中的作用等了解得還遠遠不夠。今后還需在轉運器基因的克隆和功能分析上作更深

16、入的研究，從而為提高植物光合效率提供新的思路。 3.5 碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA) CA在C4光合中是一種很關鍵的酶，它在光合作用的初始階段，催化CO2到HCO-3的快速轉化，而 HCO-3是PEPC作用的底物。據(jù)李衛(wèi)華等援引Hatch 等(1990)的研究結果，CA有兩種，即細胞質CA和葉綠體CA。C4植物體內的CA主要是細胞質CA，而C3 植物的CA主要是葉綠體CA，這兩種CA動力學性質及對CO2的親和力和對抑制劑的敏感性相似。C3植物的CA存在于葉綠體中，所以當將C4植物的PEPC基因導入C3作物的同時，是否需要考慮將C4型的CA基因一同導入，目前還未見這方面

17、的報道。 3.6 轉化受體對C4循環(huán)酶代謝反應具有種間差別 Hausler等的研究結果表明，即使是親緣關系比較近的物種如馬鈴薯和煙草，對于C4循環(huán)中基因的過量表達反應也有很大差別。例如，過量表達PEPC的轉基因煙草對于細胞質型NADP-ME的誘導與轉PEPC 馬鈴薯相比極不明顯。而且，在表達PEPC/NADP-ME 馬鈴薯的雙轉化體中，觀察到了光呼吸減弱的現(xiàn)象，而該現(xiàn)象只在轉單一PEPC基因的煙草中觀察到。C4循環(huán)酶在C3作物中代謝的種間差異將會在一定程度上阻礙高光效基因工程育種的發(fā)展。 3.7 多基因轉化 C4循環(huán)系統(tǒng)是多種酶相互作用的復雜的生化反應途徑。在高光效基因工程育種的初級階段，大多

18、研究集中于將單一C4循環(huán)酶導入C3作物中。從已有的研究結果來看，單單轉一種C4循環(huán)酶到C3作物中，其光合作用效率并沒有得到明顯的改善。目前，國外的研究已將注意力轉移到多基因的轉化上。據(jù)Hausler 等引自未發(fā)表資料表明，通過逐步轉化，已獲得了轉PEPC(或突變的內源PEPC)，NADP-ME，PPDK及 PPT基因的馬鈴薯，正等待著進行全面分析。各種轉單 C4循環(huán)基因的煙草通過雜交，已獲得了攜帶有多種C4 循環(huán)基因PEPC，NADP-ME，PPDK，PEPS (phosphoenolpyruvate synthetase)，PEPCK，PPT的各種組合的煙草。 4 前景展望 當C3植物和C4植物分別處于各自適宜的生長條件下，C4植物比C3植物高產(chǎn)。同C3植物相比，C4植物具有較高的水分和氮素利用率，這樣可增加其干物質產(chǎn)量。大約90的陸生植物包括主要的糧食作物如水稻、小麥、馬鈴薯等及主要的經(jīng)濟作物如大豆、甜菜等都