培養(yǎng)基介紹

1、 培養(yǎng)基介紹培養(yǎng)基(medium或culturemedium)是一種人工配制的、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合養(yǎng)料。因此任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的六大營養(yǎng)要素，且其間的比例是合適的。任何培養(yǎng)基一旦配成，必須立即進(jìn)行滅菌，否則很快引起雜菌叢生，并破壞其固有成分和性質(zhì)。一、選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的原則和方法在微生物學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，配制合適的培養(yǎng)基是一項(xiàng)最基本的工作。但是，許多工作不但要求我們?nèi)ミx用一種現(xiàn)成的培養(yǎng)基，而且還經(jīng)常要求親自去設(shè)計(jì)一種更合適的培養(yǎng)基，這就要求人們除了熟悉微生物的營養(yǎng)知識(shí)和規(guī)律外，還要有一套科學(xué)的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基所應(yīng)遵循的基本原則和方法。不巧的是，在一般的書籍中，這方

2、面的內(nèi)容不易找到。為此，這里根據(jù)自己的體會(huì)，提出了四個(gè)原則和四種方法，以作為總結(jié)這類工作的一個(gè)嘗試。(一)四個(gè)原則1目的明確在設(shè)計(jì)新培養(yǎng)基前，首先要明確配制該培養(yǎng)基的目的，例如，要培養(yǎng)何菌？獲何產(chǎn)物？用于實(shí)驗(yàn)室作科學(xué)研究還是用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)？作生產(chǎn)中的“種子”，還是用于發(fā)酵？等等。如果某培養(yǎng)基將用于實(shí)驗(yàn)室研究，則一般不必過多地計(jì)較其成本。但必須明確對(duì)該培養(yǎng)基是作一般培養(yǎng)用，還是作精細(xì)的生理、代謝或遺傳等研究用。如屬前者，可盡量按天然培養(yǎng)基的要求來設(shè)計(jì)，如系后者，則主要應(yīng)考慮設(shè)計(jì)一種組合培養(yǎng)基(即“合成培養(yǎng)基”，詳后)。擬培養(yǎng)的微生物對(duì)象也十分重要。不同大類的微生物，對(duì)培養(yǎng)基中碳源與氮源間的

3、比例、pH的高低、滲透壓的大小、生長因子的有無以及特殊成分的添加等都要作相應(yīng)的考慮。如果某培養(yǎng)基將用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)上，則用作“種子”的培養(yǎng)基，一般其營養(yǎng)成分宜豐富些，尤其氮源的含量應(yīng)較高(即C/N比低)；相反，如擬用作大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基，則從總體來說，它的氮源含量宜比“種子”培養(yǎng)基稍低(即C/N比高)。除了對(duì)不同類型的微生物應(yīng)考慮其特定條件外，在設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，還應(yīng)特別考慮到生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物是主流代謝產(chǎn)物，或是次生代謝產(chǎn)物。如屬主流代謝產(chǎn)物(一般指通過主要代謝途徑產(chǎn)生的那些結(jié)構(gòu)較簡單、產(chǎn)量較高、價(jià)值較低的降解產(chǎn)物)，則生產(chǎn)不含氮的有機(jī)酸或醇類時(shí)，培養(yǎng)基中所含的碳源比例自然要比生產(chǎn)

4、含氮的氨基酸類產(chǎn)物時(shí)高，反之，生產(chǎn)氨基酸類含氮量高的代謝產(chǎn)物時(shí)，氮源的比例就應(yīng)高些。如屬生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物(一般是指通過復(fù)雜合成途徑產(chǎn)生的那些結(jié)構(gòu)復(fù)雜、產(chǎn)量低、價(jià)值高的合成產(chǎn)物)，例如抗生素、維生素或赤霉素等，則還要考慮是否在其中加入特殊元素(如維生素B12中的Co)或特定前體物質(zhì)(如生產(chǎn)芐青霉素時(shí)加入的苯乙酸)。2營養(yǎng)協(xié)調(diào)通過菌體成分的分析，可知道在各種微生物的細(xì)胞中，其不同成分或元素間是有較穩(wěn)定比例的(表5-15)；另外，在異養(yǎng)微生物中，碳源還兼作能源，而能源的需要量是很大的。這兩點(diǎn)就是確定培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)要素的數(shù)量和比例的重要依據(jù)。此外，如果設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基是用于生產(chǎn)大量代謝產(chǎn)物的，那么，它所

5、需耗費(fèi)的營養(yǎng)物的量也要在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)予以充分考慮。業(yè)已清楚，在大多數(shù)化能異養(yǎng)菌的培養(yǎng)基中，各營養(yǎng)要素間在量上的比例大體符合以下十倍序列的遞減規(guī)律：要素：H2OC+能源N源P、SK、Mg生長因子含量：(10-1)(10-2)(10-3)(10-4)(10-5)(10-6)從中可以看出：水分含量最高，這是因?yàn)槲⑸锒鄶?shù)是水生性的，它們的aw值(詳后)高；碳源的含量其次，這是因?yàn)樘荚卦谌魏渭?xì)胞有機(jī)物中都是含量最高的，同時(shí)，碳源還兼有能源的作用，而能源的消耗量是很大的；N、P、S、K、Mg的含量依次遞減，這是與它們分別在細(xì)胞組分中的含量是相符的；生長因子的量最少，這是與它的生理功能相一致的。在上述序

6、列中，碳源與氮源間的相對(duì)比例即碳氮比(C/N比)，它有著十分重要的意義。嚴(yán)格地講，C/N比是指在微生物培養(yǎng)基中所含的碳源中碳原子的摩爾數(shù)與氮源中氮原子的摩爾數(shù)之比，而不能簡單地理解為某碳源的重量與某氮源的重量之比。這是因?yàn)椋煌N類的碳源或氮源，其中的含碳量或含氮量差別很大，從以下五種常用氮源的含氮量占總重量的比例即可明白其中的道理：NH3(含氮量82)CO(NH2)2(46)NH4NO3(35)(NH4)2CO3(29.2)(NH4)2SO4(21)這說明在同樣重量時(shí)，在以上各氮源中含氮量以氨為最高，尿素次之，硝酸銨和碳酸銨更次之，而硫酸銨則最低。據(jù)記載，一般培養(yǎng)基的C/N比為100/0.5

7、2；谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為100/1121，放線菌蛋白酶培養(yǎng)基為100/1020。3物理化學(xué)條件適宜(1)pH 各大類微生物一般都有它們合適的生長pH范圍。細(xì)菌的最適pH在7.08.0間，放線菌在7.58.5間，酵母菌在3.86.0間，而霉菌則在4.05.8間。對(duì)于具體的微生物種來說，它們都有特定的最適pH范圍，有時(shí)可大大突破上述一般界限(見第七章第三節(jié))。由于在微生物生長繁殖過程中會(huì)產(chǎn)生引起培養(yǎng)基pH改變的代謝產(chǎn)物，尤其是不少的微生物有很強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，如不適當(dāng)?shù)丶右哉{(diào)節(jié)，就會(huì)抑制甚至殺死其自身，因而在設(shè)計(jì)它們的培養(yǎng)基時(shí)，就要考慮到培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)能力。這種通過培養(yǎng)基內(nèi)在成分發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，就是p

8、H的內(nèi)源調(diào)節(jié)。內(nèi)源調(diào)節(jié)主要有以下兩種方法：第一種是采用磷酸緩沖液的方式。調(diào)節(jié)K2HPO4和KH2PO4兩者濃度比就可獲得從pH6.0至7.6間的一系列穩(wěn)定的pH，當(dāng)兩者為等摩爾濃度比時(shí)，溶液的pH可穩(wěn)定在pH6.8。其反應(yīng)原理如下：K2HPO4HClKH2PO4KClKH2PO4KOHK2HPO4H2O第二種是采用加入CaCO3作“備用堿”的方式。CaCO3在水溶液中溶解度極低，加入至液體或固體培養(yǎng)基中時(shí)，不會(huì)使培養(yǎng)液的pH升高。但當(dāng)微生物生長過程中不斷產(chǎn)酸時(shí)，它就逐漸被溶解，并發(fā)生以下反應(yīng)：因?yàn)镃aCO3是不溶性且是沉淀性的，故在配成的培養(yǎng)基中分布很不均勻，如因?qū)嶒?yàn)需要，也可用NaHCO3來

9、調(diào)節(jié)：與內(nèi)源調(diào)節(jié)相對(duì)應(yīng)的是外源調(diào)節(jié)，這是一種按實(shí)際需要不斷流加酸液或堿液到培養(yǎng)液中去的調(diào)節(jié)方法。具體內(nèi)容將在第七章第三節(jié)中進(jìn)行討論。(2)滲透壓和aw 滲透壓(osmoticpressure)是可用壓力來量度的一個(gè)物化指標(biāo)，它表示兩種濃度不同的溶液間被一個(gè)半透性薄膜隔開時(shí)，稀溶液中的水分子會(huì)透過此膜到濃溶液中去，直到濃溶液產(chǎn)生的機(jī)械壓力足以使兩邊的水分子進(jìn)出達(dá)到平衡為止，這時(shí)由濃溶液中的溶質(zhì)所產(chǎn)生的機(jī)械壓力，即為滲透壓。滲透壓的大小是由溶液中所含有的分子或離子的質(zhì)點(diǎn)數(shù)所決定的，等重的物質(zhì)，其分子或離子越小，則質(zhì)點(diǎn)數(shù)越多，因而產(chǎn)生的滲透壓就越大。等滲溶液適宜微生物的生長，高滲溶液會(huì)使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁

10、分離，而低滲溶液則會(huì)使細(xì)胞吸水膨脹，對(duì)細(xì)胞壁脆弱或喪失的各種缺壁細(xì)胞(如原生質(zhì)體、球狀體，支原體)來說，在低滲溶液中還會(huì)破裂。微生物在其長期的進(jìn)化過程中，發(fā)展出一套高度適應(yīng)滲透壓的特性，尤其會(huì)通過體內(nèi)大分子貯藏物的合成或分解的方式來適應(yīng)。據(jù)測(cè)定，革蘭氏陽性細(xì)菌的內(nèi)滲透壓約可達(dá)到20個(gè)大氣壓，而革蘭氏陰性細(xì)菌也可達(dá)到510個(gè)大氣壓。比滲透壓更有生理意義的一個(gè)物化指標(biāo)是aw即水活度(wateractivity)。它表示在天然環(huán)境中，微生物可實(shí)際利用的自由水或游離水的含量。要定量地表示水活度，則其含義為：在同溫同壓下，某溶液的蒸汽壓(P)與純水蒸汽壓(P0)之比。因此，aw也等于該溶液的百分相對(duì)濕度

11、(ERH，equilibriumrelativehumidity)值。即：各種微生物生長繁殖范圍的aw值在0.9980.6之間。若干有代表性微生物的最低aw值是：知道了各類微生物生長的aw值，不僅有利于設(shè)計(jì)它們的培養(yǎng)基，而且對(duì)防止食物的霉腐也有重要的意義。現(xiàn)將若干食物的aw值列舉如下：(3)氧化還原勢(shì) 氧化還原勢(shì)(redoxpotential)又稱氧化還原電位，是度量某氧化還原系統(tǒng)中的還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢(shì)的一種指標(biāo)，其單位是V(伏)或mV(毫伏)。氧化還原勢(shì)的表示方法有Eh或rH2兩種。Eh指以氫電極為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)某氧化還原系統(tǒng)的電極電位值。標(biāo)準(zhǔn)氫電極是一個(gè)半電池，它由pH為零的HCl

12、溶液、涂滿鉑黑的鉑箔電極和用壓力為1個(gè)大氣壓的氫所組成的。在這種條件下，此標(biāo)準(zhǔn)氫電極的電極電位等于零。在溶液中的某氧化還原偶，當(dāng)其氧化型和還原型的濃度相等時(shí)，所產(chǎn)生的氧化還原勢(shì)可用E0表示。任何氧化還原系統(tǒng)所產(chǎn)生的氧化還原勢(shì)明顯地受pH的影響。在生物體系中，常用E來表示pH為7時(shí)某氧化還原偶的氧化還原勢(shì)。氫電極E的上限是+0.82V，它出現(xiàn)在高氧且沒有氧消耗的環(huán)境中，下限為-0.42V，出現(xiàn)在富含氫的環(huán)境中。任何一對(duì)由氧化態(tài)物質(zhì)與還原態(tài)物質(zhì)組成的氧化還原偶，在pH等于7的情況下會(huì)產(chǎn)生一定的氧化還原勢(shì)，其數(shù)值可借它與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氫電極間所呈現(xiàn)出來的電位差值來測(cè)出。由于氫電極在使用時(shí)極感不便，因此，實(shí)

13、際上常用甘汞電極作參比電極來進(jìn)行測(cè)定。某一氧化還原系統(tǒng)在30下所產(chǎn)生的氧化還原勢(shì)數(shù)值為：上式中的n為反應(yīng)中所傳遞的電子數(shù)，ox為測(cè)定系統(tǒng)中某氧化態(tài)物質(zhì)的濃度，red為該還原態(tài)物質(zhì)的濃度。rH2表示氫分子濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，這一概念與pH是氫離子濃度的負(fù)對(duì)數(shù)的概念有類似之處。其數(shù)值為：rH2的范圍自0(氫濃度等于1個(gè)大氣壓)至42.6(氧濃度為1個(gè)大氣壓)。這就意味著，某溶液的rH2值越低，它的還原力越強(qiáng)，反之，如rH2值越高，則其氧化性越強(qiáng)。從式中還可以看出Eh、rH2與pH值三者間的關(guān)系。當(dāng)Eh值不變時(shí)，pH值越高，rH2亦越高，pH值越低，則rH2值亦越低。在許多氧化還原系統(tǒng)中，每降低一個(gè)pH值

14、，就相當(dāng)于提高Eh值0.06V。就像微生物與pH的關(guān)系那樣，各種微生物對(duì)其培養(yǎng)基的氧化還原勢(shì)也有不同的要求。一般地說，適宜于好氧微生物生長的Eh值為+0.3+0.4V，它們?cè)贓h值為0.1V以上的環(huán)境中均能生長；兼性厭氧微生物在0.1V以上時(shí)進(jìn)行好氧呼吸，在+0.1V以下時(shí)則進(jìn)行發(fā)酵；厭氧微生物只能在+0.1V以下才能生長。微生物的培養(yǎng)基常常是一個(gè)具有多對(duì)氧化還原偶的復(fù)雜電化學(xué)系統(tǒng)，這時(shí)所能測(cè)出的Eh值僅代表了它們的綜合結(jié)果。在各對(duì)氧化還原偶中，對(duì)微生物生長繁殖影響最大的是分子氧與分子氫的濃度，它們對(duì)嚴(yán)格厭氧菌的影響尤為重大。要培養(yǎng)它們，除了在配制培養(yǎng)基、滅菌、接種和培養(yǎng)等一切操作過程中必須采

15、用嚴(yán)格厭氧技術(shù)(見第七章第三節(jié))以去除氧氣外，還要在培養(yǎng)基中加入一定量的還原劑，例如可用巰基乙酸(0.010.20)、抗壞血酸(0.1)、硫化鈉(0.025)、半胱氨酸(0.05)、葡萄糖(0.11.0)、鐵屑、谷胱甘肽、氯化高鐵血紅素、二硫蘇糖醇或庖肉(瘦牛肉小塊)等來降低它的氧化還原勢(shì)值。據(jù)測(cè)定，加了鐵屑的培養(yǎng)基，其Eh值可降到0.40V的水平。除測(cè)定電極電位外，培養(yǎng)基中的Eh值還可使用氧化還原指示劑如刃天青(resazurin)等來測(cè)定。刃天青在培養(yǎng)基中的加入量一般為1mg/L(1ppm)。它在無氧條件下呈無色狀態(tài)，這時(shí)的Eh值相當(dāng)于40mV左右；在有氧條件下，其顏色與溶液的pH有關(guān)(中

16、性時(shí)呈紫色，堿性時(shí)呈藍(lán)色，酸性時(shí)呈紅色)；在微量氧時(shí)，它呈粉紅色。刃天青的變色反應(yīng)機(jī)理是：不論是好氧微生物還是厭氧微生物，隨著它們的生長和代謝活動(dòng)的進(jìn)行，培養(yǎng)基的最初氧化還原勢(shì)常會(huì)逐步下降。其原因主要是因?yàn)槿芙庋鹾脱趸蜌涫荏w的消耗和H2S、H2等還原性代謝產(chǎn)物的形成和累積。圖5-2表示在Streptomycesaureofaciens(金霉素鏈霉菌)K1001的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液氧化還原勢(shì)值的變化及其與產(chǎn)生金霉素的關(guān)系。4經(jīng)濟(jì)節(jié)約 經(jīng)濟(jì)節(jié)約主要指在設(shè)計(jì)生產(chǎn)實(shí)踐中所使用的大量培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)遵循的原則。這方面的潛力是極大的。綜合各方面的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)濟(jì)節(jié)約的原則大體可分為以下八個(gè)方面。(1)以粗代精

17、一般地說，“粗”與“精”的概念是人為劃分的。對(duì)人來說是一種“精”的營養(yǎng)料(如精白糖)，對(duì)微生物往往卻是一種不完全的養(yǎng)料，而對(duì)一般人只認(rèn)為是“粗”的營養(yǎng)料(如紅糖)，對(duì)微生物倒反而是一種較完全的養(yǎng)料。從這一點(diǎn)出發(fā)，就可以在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)充分利用各種粗原料。(2)以“野”代“家” 主要指以野生植物原料代替栽培植物原料。如木薯、橡子、薯芋、土茯苓、金剛刺和苦楝子等都是富含淀粉質(zhì)的野生植物，可以部分取代糧食用于發(fā)酵工業(yè)中的碳源；許多含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等的植物秸稈，可以作為栽培食用菌的良好養(yǎng)料。(3)以廢代好 以工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中易污染環(huán)境的廢棄物作為微生物培養(yǎng)基的原料，是大有可為的，例如，造紙廠的亞

18、硫酸廢液(含有戊糖和短小纖維)、各種發(fā)酵廢液(酒精及丙酮丁醇發(fā)酵廢醪、味精發(fā)酵廢液)、各種釀造工業(yè)廢棄物(啤酒糟、酒糟、醬渣)以及其他工業(yè)廢棄物(花生麩、淀粉渣、胚芽餅、豆腐渣、屠宰水、黃漿水、蠶繭脫膠廢水、粉絲廠廢水)等。在利用這類原料生產(chǎn)酵母菌等單細(xì)胞蛋白方面，國內(nèi)外已有很多成功的例子。(4)以簡代繁 生產(chǎn)上在改進(jìn)培養(yǎng)基成分時(shí)，一般都以“加法”居多，即設(shè)法使其營養(yǎng)越來越豐富、含量越來越高。這對(duì)微生物的生長不一定都有利。有時(shí)可試用“減法”，即用稀薄的培養(yǎng)基或成分較少的培養(yǎng)基來代替原有培養(yǎng)基成分，以求達(dá)到更好的效果。例如，某制藥廠在改進(jìn)鏈霉素發(fā)酵培養(yǎng)基原有配方中，曾設(shè)法減去3050的黃豆餅粉、

19、25葡萄糖和20硫酸銨，結(jié)果反而提高了產(chǎn)量(表5-16)；又如，某廠在卡那霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中將原來的12種成分減少為7種，結(jié)果仍可維持原有的產(chǎn)量。(5)以烴代糧 即以石油或天然氣代替糖質(zhì)原料來培養(yǎng)微生物。能利用石油作為碳源和能源的微生物在自然界中普遍存在，據(jù)知至少有8屬細(xì)菌、6屬放線菌、6屬酵母和6屬霉菌能利用石油。不同的微生物幾乎能利用石油中所含的所有成分，除了合成菌體成分石油蛋白外，還能將其氧化成醇、醛、酸等化工產(chǎn)品。在當(dāng)前石油資源逐漸趨向緊缺的情況下，如能拿出一部分石油作發(fā)酵原料，讓微生物將它轉(zhuǎn)化成一些產(chǎn)值較高的高級(jí)醇、脂肪酸和環(huán)烷酸等化工產(chǎn)品和若干合成產(chǎn)物，還是十分值得的。(6)以纖代糖

20、 纖維素是一種由14000個(gè)左右的葡萄糖單位構(gòu)成的-D-葡萄糖長鏈，是自然界中最豐富的有機(jī)物?？墒?，人類和動(dòng)物都無法直接消化這一取之不盡、用之不竭的可再生資源。在自然界中，存在著大量分解纖維素的微生物，它們能分泌各種纖維素酶，例如內(nèi)-1，4-葡聚糖酶(分解大分子中央的-1，4鍵，產(chǎn)生含游離末端的長鏈片段)，外-1，4-葡聚糖酶(從纖維素鏈的末端上不斷水解出纖維二糖單位)，以及-葡糖苷酶(將纖維二糖水解成葡萄糖)。因此，有可能利用這些微生物將大量的農(nóng)副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成優(yōu)質(zhì)飼料、工業(yè)發(fā)酵原料、燃料以及人類的食品或飲料。例如有的國家利用Candidawickerharmii(維氏假絲酵母)將纖維糊精通過3

21、4天發(fā)酵產(chǎn)生乙醇(54g/L纖維糊精可產(chǎn)生29.2g/L乙醇)；也有用Clostridiumthermocellum(熱纖梭菌)在5560下的厭氧條件下將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，然后再轉(zhuǎn)化為乙醇；在日本，有人用厭氧菌Ruminococcusalbus(白色瘤胃球菌)將球磨纖維素(80g/L)發(fā)酵產(chǎn)生酒精(18g/L)和醋酸(23g/L)；目前，優(yōu)良的Trichodermaviride(綠色木霉)變異株每毫升發(fā)酵液的纖維素酶活力已超過7500單位；近來，還有人找到一株能利用纖維素生產(chǎn)乙醇的耐熱性酵母Fabosporafragilis(脆弱豆孢酵母)CCY51-1-1。這些都為“以纖代糖”提供了令人鼓

22、舞的應(yīng)用前景。據(jù)估計(jì)，我國每年有稻草、麥稈、稻殼、棉子殼和玉米芯五項(xiàng)含纖維素豐富的資源4億噸以上，如能充分加以利用，這將是一個(gè)巨大的生物資源庫。(7)以氮代朊 即以大氣氮、銨鹽、硝酸鹽或尿素等一類非蛋白質(zhì)或非氨基酸原料用作發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，讓微生物轉(zhuǎn)化成菌體蛋白質(zhì)或含氮的發(fā)酵產(chǎn)物供人們利用(見本章第一節(jié)“氮源”)。(8)以“國”代“進(jìn)” 即以國產(chǎn)原料代替進(jìn)口原料，這實(shí)際上是“以粗代精”原則的一種特殊形式。典型的例子是50年代初在我國建立抗生素工業(yè)的早期，因?yàn)閲鴥?nèi)缺乏乳糖及玉米漿這兩種青霉素發(fā)酵的主要原料而影響到生產(chǎn)的發(fā)展。我國學(xué)者經(jīng)過研究，終于找到了以國內(nèi)資源極其豐富的棉子餅粉或花生餅粉代替

23、玉米漿，以玉米粉代替進(jìn)口乳糖的新的培養(yǎng)基配方，后來又進(jìn)一步以流加葡萄糖代替乳糖的新工藝，使青霉素產(chǎn)量超過當(dāng)時(shí)國外乳糖發(fā)酵的水平，從而建立了具有中國特色的青霉素發(fā)酵工業(yè)。(二)四種方法1生態(tài)模擬 在自然條件下，凡有某微生物大量生長繁殖的環(huán)境，則可認(rèn)為該處一定具備該微生物生長繁殖所必需的營養(yǎng)和其他條件。因此，就可以模擬該天然基質(zhì)或直接取用該天然基質(zhì)(經(jīng)過滅菌)來培養(yǎng)相應(yīng)的微生物。在實(shí)踐中，的確可以利用生態(tài)模擬的辦法來配制各類“初級(jí)的”天然培養(yǎng)基。例如，可用肉湯、魚汁來培養(yǎng)多種細(xì)菌；用水果汁來培養(yǎng)各種酵母菌；用潤濕的麩皮、米糠來培養(yǎng)多種霉菌；用米飯或面包來培養(yǎng)根霉；用肥土來培養(yǎng)放線菌；以及用玉米芯來

24、培養(yǎng)脈孢菌(Neurosporaspp.)，等等。2查閱文獻(xiàn) 一個(gè)科學(xué)工作者決不能事事都依靠直接經(jīng)驗(yàn)。多查閱、分析和利用一切文獻(xiàn)資料上的對(duì)自己直接或間接有關(guān)的信息，對(duì)設(shè)計(jì)有自己特色的培養(yǎng)基配方有著重要的參考價(jià)值。3精心設(shè)計(jì) 在設(shè)計(jì)、試驗(yàn)新配方時(shí)，常常要進(jìn)行各項(xiàng)因素的比較或反復(fù)試驗(yàn)，因此，工作量是很大的。為了提高工作效率，應(yīng)努力借助優(yōu)選法或正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法等行之有效的數(shù)學(xué)工具。4試驗(yàn)比較 要設(shè)計(jì)一種優(yōu)化的培養(yǎng)基，在上述三個(gè)方法的基礎(chǔ)上，最終還得通過實(shí)際試驗(yàn)和比較來加以確定。試驗(yàn)的規(guī)模一般都遵循由定性到定量、由小而大地逐步擴(kuò)大的原則。例如，可先在培養(yǎng)皿上作生長譜試驗(yàn)(auxanographicmet

25、hod)，然后進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)，再進(jìn)行臺(tái)式發(fā)酵罐試驗(yàn)，最后才擴(kuò)大到試驗(yàn)型發(fā)酵罐和生產(chǎn)型發(fā)酵罐的規(guī)模。生長譜試驗(yàn)的基本操作是這樣的：如果我們要試的是某一微生物的碳源，則先準(zhǔn)備一個(gè)不加碳源的瓊脂培養(yǎng)基，待融化并冷卻至45左右時(shí)，混入供試菌懸液，搖勻后倒成瓊脂平板，俟其凝固后，將待試碳源一一用小鑷子夾取少許并整齊地放在平板上。經(jīng)溫箱培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后，凡在某碳源周圍出現(xiàn)該菌的“生長圈”者，即為它可利用的碳源。用同樣原理也可尋找合適氮源和生長因子。二、培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的名目繁多，種類各異，為便于掌握系統(tǒng)化的知識(shí)，這里對(duì)其進(jìn)行以下分類并舉例介紹。(一)按對(duì)培養(yǎng)基成分的了解來分培養(yǎng)基中所含的營養(yǎng)要素雖都一樣

26、，但具體成分卻可迥然不同。如果按人們對(duì)其中成分的了解程度來分類有以下三類：1天然培養(yǎng)基(complexmedium；undefinedmedium) 這是指一些利用動(dòng)、植物或微生物體或其提取物制成的培養(yǎng)基，人們無法確切知道其中的成分。例如培養(yǎng)各種細(xì)菌所用的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基等。天然培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是取材方便、營養(yǎng)豐富、種類多樣、配制方便；缺點(diǎn)是成分不穩(wěn)定也不甚清楚，因而在做精細(xì)的科學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，會(huì)引起數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。因此，天然培養(yǎng)基只適合配制實(shí)驗(yàn)室用的各種基本培養(yǎng)基及大生產(chǎn)中的種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基之用?，F(xiàn)將幾種用于配制天然培養(yǎng)基的常用原材料的特性列于表5-17。2組合培養(yǎng)基(de

27、finedmedium) 又稱合成培養(yǎng)基或綜合培養(yǎng)基(syntheticmedium)，是一類用多種高純化學(xué)試劑配制成的、各成分(包括微量元素)的量都確切知道的培養(yǎng)基。例如培養(yǎng)細(xì)菌的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌的淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基(即高氏一號(hào)培養(yǎng)基)，培養(yǎng)真菌的蔗糖硝酸鹽培養(yǎng)基*(即察氏培養(yǎng)基)等。組合培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是成分精確、重演性高；缺點(diǎn)是價(jià)格較貴、配制較煩。因此，一般僅用于作營養(yǎng)、代謝、生理、生化、遺傳、育種、菌種鑒定和生物測(cè)定等定量要求較高的研究工作上。習(xí)慣常以該培養(yǎng)基中所含的碳源和氮源名稱來作該培養(yǎng)基的名稱，也有以設(shè)計(jì)人的姓名來命名的。3半組合培養(yǎng)基(semi-definedmedium

28、) 既含有天然成分又含有純化學(xué)試劑的培養(yǎng)基即稱半組合培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)真菌用的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。嚴(yán)格地講，凡含有未經(jīng)特殊處理的瓊脂的任何組合培養(yǎng)基，實(shí)質(zhì)上都只能看作是一種半組合培養(yǎng)基。(二)按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)來分如按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)來分，培養(yǎng)基可分成三類。1固體培養(yǎng)基(solidmedium) 外觀呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基，稱為固體培養(yǎng)基。根據(jù)固體的性質(zhì)又可把它分為4種類型：凝固培養(yǎng)基(solidifiedmedium)，如在液體培養(yǎng)基中加入12瓊脂或512明膠作凝固劑，就可以制成遇熱可融化、冷卻后則凝固的固體培養(yǎng)基，此即凝固培養(yǎng)基。它在各種微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作中有極其廣泛的用途。瓊脂具有一系

29、列優(yōu)良性能(表5-18)，因此從上世紀(jì)80年代初開始用于配制微生物培養(yǎng)基后，立即就取代了原有的明膠凝固劑。非可逆性凝固培養(yǎng)基，指由血清凝固成的固體培養(yǎng)基或由無機(jī)硅膠配成的當(dāng)凝固后就不能再融化的固體培養(yǎng)基，其中的硅膠平板是專門用于化能自養(yǎng)微生物分離、純化的固體培養(yǎng)基。天然固體培養(yǎng)基，由天然固體狀基質(zhì)直接制成的培養(yǎng)基，例如培養(yǎng)各種真菌用的由麩皮、米糠、木屑、纖維、稻草粉等配制成的固體培養(yǎng)基；由馬鈴薯片、胡蘿卜條、大米、麥粒、面包、動(dòng)物或植物組織制備的固體培養(yǎng)基等。濾膜(membranefilter)，是一種堅(jiān)韌且?guī)в袩o數(shù)微孔的醋酸纖維薄膜，如果把它制成圓片狀覆蓋在營養(yǎng)瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維素襯墊上

30、，就形成了具有固體培養(yǎng)基性質(zhì)的培養(yǎng)條件。濾膜主要用于對(duì)含菌量很少的水中微生物的過濾、濃縮，然后揭下濾膜，把它放在含適當(dāng)營養(yǎng)液的襯墊上進(jìn)行培養(yǎng)，待長出菌落后，可計(jì)算出單位水樣中的含菌量。固體培養(yǎng)基在科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐上具有廣闊的用途，例如，它可用于菌種的分離、鑒定，菌落計(jì)數(shù)，檢驗(yàn)雜菌，選種、育種，菌種保藏，抗生素等生物活性物質(zhì)的生物測(cè)定，獲取大量真菌孢子，以及用于微生物產(chǎn)品的“土法生產(chǎn)”(一般指用固體培養(yǎng)法進(jìn)行生產(chǎn))，等等。2半固體培養(yǎng)基(semi-solidmedium) 在凝固性固體培養(yǎng)基中，如凝固劑含量低于正常量，培養(yǎng)基呈現(xiàn)出在容器倒放時(shí)不致流下、但在劇烈振蕩后則能破散的狀態(tài)，這種固體培養(yǎng)

31、基即稱半固體培養(yǎng)基，它一般加有0.5左右的瓊脂作凝固劑。半固體培養(yǎng)基在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有許多獨(dú)特的用途，如細(xì)菌的動(dòng)力觀察(在半固體直立柱中央進(jìn)行細(xì)菌的穿刺接種，觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力)，噬菌體效價(jià)測(cè)定(雙層平板法)，微生物趨化性的研究，各種厭氧菌的培養(yǎng)以及菌種保藏，等等。3液體培養(yǎng)基(liquidmedium) 液體培養(yǎng)基是指呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基，它在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)中應(yīng)用極其廣泛。在實(shí)驗(yàn)室中主要作各種生理、代謝研究和獲得大量菌體之用；在生產(chǎn)實(shí)踐上，絕大多數(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基都采用液體培養(yǎng)基。(三)按培養(yǎng)基的功能來分1選擇性培養(yǎng)基(selectedmedium) 選擇性培養(yǎng)基就是根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求

32、或其對(duì)某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，其功能是使混合菌樣中的劣勢(shì)菌變成優(yōu)勢(shì)菌，從而提高該菌的篩選效率。這種培養(yǎng)基是在上世紀(jì)末由荷蘭的M.W.Beijerinck和俄國的S.N.Vinogradsky發(fā)明的。我國勞動(dòng)人民在12世紀(jì)(宋代)時(shí)，已根據(jù)紅曲霉有耐酸和耐高溫的特性，采用了明礬來調(diào)節(jié)酸度和用酸米來抑制雜菌的方法，培養(yǎng)出純度很高的紅曲，這實(shí)際上就是一種選擇性培養(yǎng)基?；旌蠘悠分袛?shù)量很少的某種微生物，如直接采用平板劃線或稀釋法進(jìn)行分離，必難以奏效。這時(shí)，第一種辦法可利用該分離對(duì)象對(duì)某一營養(yǎng)物質(zhì)有一“嗜好”的原理，專門在培養(yǎng)基中加入該營養(yǎng)物，從而使它成為一種加富培養(yǎng)基(enrichedmedium)。采用這類“投其所好”的策略即可使該微生物大大增殖，在數(shù)量上超過原有占優(yōu)勢(shì)的微生物，以達(dá)到富集培養(yǎng)的目的。第二種辦法則可利用該分離對(duì)象對(duì)某種制菌物質(zhì)的抗性，在混合培養(yǎng)物中加入該抑制物質(zhì)，經(jīng)培養(yǎng)后，由于原來占優(yōu)勢(shì)的它種微生物的生長受到抑制，而分離對(duì)象卻可趁機(jī)大大增殖，使之在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢(shì)。通過這種“取其所抗”的辦法，也可達(dá)到富集培養(yǎng)的目的。用于加富的營養(yǎng)物主要是一些特殊的碳源和氮源，如纖維素可被用來富集纖維素分解微生物，甘露醇用來富集自生固氮菌，石蠟油用來富集分解石油的微生物，以及用較濃的糖液來富