2022年細(xì)胞凍存復(fù)蘇傳代轉(zhuǎn)染VIP

1、細(xì)胞培養(yǎng)系列方法【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備好高壓的離心管、凍存管、1ml/100ul槍頭、PBS溶液。2清潔超凈工作臺(tái)面，照紫外30分鐘；同時(shí)根據(jù)需要將培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶PBS液、雙抗置于室溫下復(fù)溫。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇【實(shí)驗(yàn)用品】（1） 材料：培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞70%-80%融合、于液氮中凍存的細(xì)胞（2） 試劑： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲亞砜DMSO、雙抗（3） 設(shè)備：培養(yǎng)瓶、巴氏吸管、15ml離心管、1.5ml凍存管、盛酒精的噴壺、酒精燈、水浴鍋、CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、液氮灌、倒置顯微鏡、超凈工作臺(tái)。試劑配制：1完全培養(yǎng)基含90%DMEM培養(yǎng)液加10%的胎

2、牛血清加1%的雙抗。2凍存液含80%的DMEM培養(yǎng)基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混勻，置于4冰箱中備用。細(xì)胞的凍存(1) 依照傳代的方法用0.25%胰蛋白酶液對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層細(xì)胞進(jìn)展消化。(2) 收集消化細(xì)胞于離心管中，800-1000r/min離心5min。(3) 棄上清液，參加適量?jī)龃嬉?，用吸管吹打?xì)胞制懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5*106-1*107個(gè)/ml。(4) 每個(gè)凍存管分裝細(xì)胞懸液1.5ml，旋緊凍存管的蓋，并用封口膜密封。(5) 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng)、凍存時(shí)間、凍存人名等。(6) 將凍存管置于如下條件下逐步加以?xún)龃妫?,0.5h-20，1h-80，過(guò)夜轉(zhuǎn)入液氮

3、灌中。細(xì)胞的復(fù)蘇（1） 準(zhǔn)備水浴鍋，調(diào)溫度至38。翻開(kāi)離心機(jī)。（2） 用止血鉗從液氮灌中取出細(xì)胞凍存管1只，迅速將其置入38水浴鍋中，不斷搖動(dòng)使凍存的細(xì)胞懸液盡快融化。（3） 用酒精棉球擦拭凍存管，放入超凈工作臺(tái)中。（4） 將已融化的細(xì)胞懸液用吸管移入離心管中，加10倍體積的DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻。（5） 1500r/min離心4min，棄上清液。（6） 參加培養(yǎng)液吹打沉淀的細(xì)胞，使其懸浮，對(duì)細(xì)胞進(jìn)展計(jì)數(shù)。（7） 按5*105個(gè)/ml的細(xì)胞濃度，將細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（8） 24h后取出培養(yǎng)瓶，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況?！究记绊氈浚?） 對(duì)數(shù)期的細(xì)胞增值能力強(qiáng)，凍存后生存率較高，

4、因此，在進(jìn)展細(xì)胞凍存時(shí)，應(yīng)盡量選擇處于此期的細(xì)胞加以?xún)龃?。?） 為了保證復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率，復(fù)蘇接種時(shí)，細(xì)胞的濃度不能太低，最好控制在5*106-1*107個(gè)/ml，這樣才能保證復(fù)蘇成功。（3） 凍存管的瓶蓋應(yīng)封蓋嚴(yán)密，以免復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞外溢。（4） 復(fù)蘇時(shí)，從液氮取出凍存管到水浴中融化的過(guò)程要快，否那么會(huì)導(dǎo)致冰晶的形成，傷害細(xì)胞。同時(shí)，一次復(fù)蘇的凍存管數(shù)量不要太多，否那么會(huì)引起水浴鍋中傳熱不佳，延緩凍存的細(xì)胞懸液融化的時(shí)間。（5） 為防止液氮凍傷，注意戴上防護(hù)手套?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果及分析】經(jīng)復(fù)蘇剛接種的細(xì)胞是懸浮于培養(yǎng)基中的。復(fù)蘇成功的細(xì)胞24h左右可貼壁，48h后即可開(kāi)場(chǎng)生長(zhǎng)、增殖。復(fù)蘇不成功的細(xì)

5、胞，將繼續(xù)懸浮于培養(yǎng)液中，不能貼壁。細(xì)胞的傳代培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)用品】 （1） 材料：原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞、原代培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞（2） 試劑：PBS液、DMEM培養(yǎng)基含10%小牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液（3） 設(shè)備：25ml培養(yǎng)瓶、吸管、離心管、酒精棉球、酒精燈、離心機(jī)、倒置顯微鏡、超凈工作臺(tái)、C02培養(yǎng)箱【實(shí)驗(yàn)方案】 1. 貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)（1） 用吸管吸出原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液。（2） 向瓶?jī)?nèi)參加適量的PBS液，輕輕搖動(dòng)后倒掉。（3） 每25ml的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)參加0.25%胰蛋白酶消化液1ml，消化液的量以覆蓋整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)面為宜，置于37的培養(yǎng)箱環(huán)境中。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，在倒置顯微鏡下對(duì)

6、培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)展觀察，當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，迅速將消化液吸出。（4） 參加PBS液于培養(yǎng)瓶中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，然后用吸管將溶液吸出，參加含血清的培養(yǎng)液終止消化。（5） 用吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打瓶壁，制備細(xì)胞懸液。吹打的部位應(yīng)均勻，可按從上到下、從左到右的順序進(jìn)展，保證瓶底各個(gè)部位的細(xì)胞均能被吹到。此外，吹打時(shí)不能用力過(guò)猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞。（6） 將吹打后的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)原貼壁的細(xì)胞均已懸浮于培養(yǎng)液中，成片的細(xì)胞已分散成小的細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞，即可終止吹打。（7） 收集細(xì)胞懸液于離心管中，1000r/min，離心5-8min，去除上清。（8） 細(xì)胞計(jì)數(shù)，按

7、照1*105-1*106個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞于新培養(yǎng)瓶中。2. 懸浮細(xì)胞的傳代（1） 將原代培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管中。（2） 800-1000r/min離心5min，去除上清液。（3） 加新的培養(yǎng)液到離心管中，吸管吹打、制懸。根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量多少，將細(xì)胞懸液按1:2或1:3的比例分別接種于新的培養(yǎng)瓶中?！究记绊氈?（1） 消化過(guò)程中需根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化來(lái)嚴(yán)格控制消化時(shí)間。當(dāng)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間的連接變松散等情況出現(xiàn)時(shí)，應(yīng)終止消化。因上皮樣細(xì)胞彼此間連接較為嚴(yán)密，其消化時(shí)的時(shí)間通常比成纖維細(xì)胞長(zhǎng)。此外，首次傳代的細(xì)胞與已建系的細(xì)胞相比，也需要更多的消化時(shí)間。（2） 首次傳

8、代的細(xì)胞因需適應(yīng)新的環(huán)境，可適當(dāng)增加其接種量，以促進(jìn)生存與增殖。（3） 在對(duì)細(xì)胞進(jìn)展吹打時(shí)，不能用力過(guò)猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞。（4） 傳代培養(yǎng)的過(guò)程通常較長(zhǎng)，細(xì)胞被污染的可能增加，因此，必須嚴(yán)格進(jìn)展無(wú)菌操作。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析】 用倒置顯微鏡觀察可見(jiàn)接種24h后，大多數(shù)肝細(xì)胞已貼附于培養(yǎng)瓶底部，有少數(shù)細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。48h以后，細(xì)胞開(kāi)場(chǎng)增殖、細(xì)胞的數(shù)量增多，在接種的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞團(tuán)周?chē)梢?jiàn)新生細(xì)胞長(zhǎng)出，這些細(xì)胞內(nèi)含物少而較為透明，胞體輪廓通常較淺。96h以后，培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并逐漸集合，細(xì)胞輪廓清晰、可見(jiàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染【實(shí)驗(yàn)用品】 細(xì)胞、6孔板、血清、培養(yǎng)基DMEM、OPTI-M

9、EM、GSK-3/wt的質(zhì)粒、Lipofectamine2000、GSK-3/wt的質(zhì)粒、鏈霉素/青霉素雙抗、FCS小牛血清、PBS磷酸鹽緩沖溶液、胰酶1. 細(xì)胞的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前一天，將細(xì)胞接種入6孔板中，每孔中培養(yǎng)基的體積為1ml，細(xì)胞環(huán)境控制在37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞到達(dá)90%豐度時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前一晚?yè)Q新鮮的有血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞狀態(tài)良好。2.轉(zhuǎn)染GSK-3/wt的質(zhì)粒(1) 準(zhǔn)備無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM，OPTI-MEM，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000。(2) 轉(zhuǎn)染前一小時(shí)棄去培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，換預(yù)先預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基。(3) 根據(jù)Lip-2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明

10、書(shū)算出所需要的Lip-2000的體積，根據(jù)各轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的濃度算出各自所需體積見(jiàn)表2。 表2 所用質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的量Culture VesselSurface AreaPer Well(cm2)Relative SurfaceArea(vs.24-well)Volume of PlatingMediumDNA(ug) andDilution Volume(ul)Lipofectamine2000(ul)And DilutionVolume(ul)6-well1052ml4.0ug in 250ul10ul in 250ul(4) 將質(zhì)粒參加OPTI-MEM，輕輕混勻。(5) 將Lipofectam

11、ine2000參加OPTI-MEM后輕輕混勻后，并計(jì)時(shí)孵育5分鐘。(6) 將質(zhì)粒參加Lipofectamine2000中，輕輕混勻后，計(jì)時(shí)孵育20分鐘。(7) 20分鐘后緩慢將Lipofectamine2000-質(zhì)?；旌衔飬⒓优囵B(yǎng)孔中。(8) 37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。(9) 提取細(xì)胞蛋白?？记绊氈?） 傳代細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24h傳代，待細(xì)胞密度達(dá)90%豐度時(shí)即可進(jìn)展轉(zhuǎn)染。如果轉(zhuǎn)染前細(xì)胞生長(zhǎng)缺乏12h，細(xì)胞就不能很好地吸附在培養(yǎng)皿上，與脂類(lèi)接觸時(shí)易于脫落。（2） 用Lipofectin轉(zhuǎn)染時(shí)，不要用聚丙烯試管，因?yàn)長(zhǎng)ipofectin中的陽(yáng)離子脂類(lèi)會(huì)與聚丙烯發(fā)生非特

12、異結(jié)合，而影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。（3） 在添加DNA-脂質(zhì)體混合液前，用無(wú)血清培養(yǎng)液充分洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞很重要，因?yàn)檠鍟?huì)強(qiáng)力抑制轉(zhuǎn)染；有些胞外基質(zhì)復(fù)合物，如硫酸蛋白聚糖，也可抑制轉(zhuǎn)染。（4） GFP表達(dá)的影響因素主要與轉(zhuǎn)染時(shí)的溫度、PH值和觀察時(shí)間有關(guān)。同一表達(dá)載體轉(zhuǎn)染同一種細(xì)胞后，分別在33和37條件下培養(yǎng)，那么33條件下培養(yǎng)者可觀察到較強(qiáng)的熒光，而37條件下培養(yǎng)者熒光較弱，其原因可能是37時(shí)三肽環(huán)狀構(gòu)造不易形成。培養(yǎng)液的PH值也顯著影響GFP的熒光特性，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于33、5%CO2條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)液為堿性時(shí)熒光較強(qiáng)，培養(yǎng)液為酸性時(shí)熒光減弱。熒光強(qiáng)度一般在轉(zhuǎn)染后48h最強(qiáng)，這可能是一方面與GFP的表達(dá)量有關(guān)，另一方面與細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)。因此，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)染時(shí)的