流式細(xì)胞儀原理及操作步驟

1、流式細(xì)胞儀原理及操作步驟流式細(xì)胞儀(FCM)是八十年月集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計(jì)算機(jī)等高技術(shù)進(jìn)展起來(lái)的一種先進(jìn)儀器，已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的商量和臨床常規(guī)工作。其中檢測(cè)人白細(xì)胞表面標(biāo)志可對(duì)白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對(duì)淋巴細(xì)胞群和亞群進(jìn)行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細(xì)胞。活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是用于FCM檢測(cè)的標(biāo)本籌備，染色后也能在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，在某些實(shí)驗(yàn)條件下，活細(xì)胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的結(jié)果。(一)原理活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再

2、用熒光標(biāo)記的其次抗體結(jié)合，依據(jù)所測(cè)定的熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。(二)操作步驟制備活性高的細(xì)胞懸液(培育細(xì)胞系、外周血單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法)用10FCSRPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10×10ml取40l細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(550l)的小玻璃管或塑料離心管，再加50l 120(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm×5min棄上清，加入50l工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，充分振搖4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右100

3、0rpm×5min加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細(xì)胞濃度加入100500l固定液)FCM檢測(cè)或制片后熒光顯微鏡下觀察(標(biāo)本在試管中可保存57天)(三)試劑和器材1.各種特異性單克隆抗體。2.熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠其次抗體，滅活正常兔血清。3.10 FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。4.玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡等。(四)注意事項(xiàng)1.整個(gè)操作在4下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。2.洗滌要充分，紅外碳硫儀以避開游離抗體封

4、閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，消失假陰性。3.加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。4.細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附:1. DPBS (×10, 貯存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸餾水加至1000mlNaHPO 11.5g 臨用時(shí)用蒸餾水110稀釋KHPO 2g2.洗滌液DPBS900mlFCS 50ml (終濃度5)4NaN50ml (終濃度0.2)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (終濃度2)甲醛10mlNaN0.2g (終濃度0.02)內(nèi)容總結(jié)（1）流式細(xì)胞儀原理及操作步驟流式細(xì)胞儀(FCM)是八十年月集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計(jì)算機(jī)等高技術(shù)進(jìn)展