胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展

1、胚胎干細(xì)胞的商量進(jìn)展摘要：胚胎干細(xì)胞 (embryonic stem cells, ES cells) 是存在于胚胎發(fā)育早期階段，具有自我更新和多分化潛能性的干細(xì)胞，是組成機(jī)體各種組織器官的起源細(xì)胞。已經(jīng)廣泛用于生命科學(xué)的很多領(lǐng)域，它在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的商量熱點(diǎn)。本文綜述了近些年關(guān)于胚胎干細(xì)胞分離培育與鑒定特征和應(yīng)用的商量進(jìn)展，同時(shí)也指出了目前所面臨的問題，對(duì)今后的商量方向進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：胚胎干細(xì)胞；分離培育與鑒定特征；應(yīng)用胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞）是一種從早期胚胎的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞或胎兒原始生殖細(xì)胞( primordial germ cell

2、s，PGCs) 中經(jīng)分離體外抑制分化培育得到的具有發(fā)育全能性( 或多能性) 的一類干細(xì)胞，與已經(jīng)成熟分化的體細(xì)胞一樣，ES細(xì)胞也是一分為二地分裂增殖，且ESC具有體外培育無限增殖自我更新和多向分化的特性。在肯定的培育條件下，ES細(xì)胞可以在體外長(zhǎng)期和穩(wěn)定地自我復(fù)制，實(shí)現(xiàn)永生，無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)中外3個(gè)胚層的幾乎全部類型細(xì)胞。因此，ES細(xì)胞成為商量哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)生細(xì)胞組織分化基因表達(dá)調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)商量的一個(gè)特別抱負(fù)的模型系統(tǒng)和特別有用的工具，也是進(jìn)行動(dòng)物胚胎工程開發(fā)和用于治療各種疾病，修復(fù)受損傷的組織和器官的一個(gè)重要途徑，具有廣泛的應(yīng)用前景1,2。20世紀(jì)

3、末開頭，ES細(xì)胞的商量就始終是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。美國(guó)科學(xué)雜志評(píng)出的上個(gè)世紀(jì)十大科學(xué)突破中，“干細(xì)胞商量與應(yīng)用”名列榜首。ES細(xì)胞的商量還處于起步階段，目前人們已經(jīng)能夠分離培育干細(xì)胞，但誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化還面臨很多困難。1 胚胎干細(xì)胞的概念和商量歷史胚胎干細(xì)胞商量的起源來自20世紀(jì)70年月對(duì)畸胎瘤的商量：有人把早期的小鼠胚胎移植到成年小鼠體內(nèi)后產(chǎn)生了畸胎癌( 即惡性的畸胎瘤) ，畸胎癌內(nèi)的細(xì)胞( 即EC，胚胎癌細(xì)胞) 能在體外自我更新且能分化成不同種類的細(xì)胞，由于這種類型的畸胎癌只能由著床前的早期小鼠胚胎產(chǎn)生，因此推測(cè)EC細(xì)胞的來源是胚胎發(fā)育早期短暫消失的外胚層細(xì)胞( epiblast) 關(guān)

4、于EC細(xì)胞的商量使科學(xué)家認(rèn)為可能從小鼠早期胚胎中分離到一種能分化成多種細(xì)胞的具有全能性的干細(xì)胞，即胚胎干細(xì)胞( ESC)。 ES細(xì)胞商量，首先源于畸胎瘤干細(xì)胞(teratocarcinoma stem cell)或胚胎瘤細(xì)胞(embryoniccarcinoma cell , EC細(xì)胞)。1958年，Steven通過把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或腎臟被膜下得到了EC細(xì)胞。1981年，英國(guó)劍橋高校的Evans和Kaufman3用延緩著床的胚泡和美國(guó)加州高校舊金山分校的Martin用條件培育基分別成功地分離、體外培育了小鼠的ES，從今進(jìn)入了胚胎干細(xì)胞培育建系的新紀(jì)元。此后，人們建立了很多動(dòng)物

5、的ES細(xì)胞系，1990年，Evans4、Strojek5各自成功地建立了豬類ES細(xì)胞系。1992年，Matsui6等用小鼠原始生殖細(xì)胞首先建成EC細(xì)胞系，又開創(chuàng)了一種新的建立全能性(或多能性)細(xì)胞系的材料。1994年，Robert7用牛原始生殖細(xì)胞建成EC細(xì)胞系，證明白原始生殖細(xì)胞可以作為建立全能性(或多能性)細(xì)胞系的新型材料。1995年Thomson8等從恒河猴的胚囊中分離、建立了ES細(xì)胞株，這是第一個(gè)建株的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的ES。近年來，美國(guó)Wiscosin高校的Thomson和Hopkins高校的Gearhart分別用不同的方法成功的得到了幾個(gè)人的ES細(xì)胞系，這一工作奠定了對(duì)人ES實(shí)驗(yàn)商量的基

6、礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)在細(xì)胞胚胎干方面的綜合性商量雖然起步較晚(1989年) ，但進(jìn)展特別迅速，在基礎(chǔ)商量方面，尚克剛賴學(xué)良等已先后建立了小鼠和兔細(xì)胞系，盛惠珍商量小組在國(guó)際上首次構(gòu)建了人-兔核移植重構(gòu)胚。在應(yīng)用商量方面，竇忠英的科研小組已第6次從人類胚胎干細(xì)胞中分化誘導(dǎo)得到心臟跳動(dòng)樣細(xì)胞團(tuán)，中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院發(fā)現(xiàn)了人胚胎干細(xì)胞素，用于臨床多種疾病的治療取得了明顯效果9。2 胚胎干細(xì)胞的特征2.1 胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特征 ES細(xì)胞顯著區(qū)分于其他細(xì)胞：（1）ES細(xì)胞具有全能性，體外培育可誘導(dǎo)分化成機(jī)體的任何組織細(xì)胞類型。細(xì)胞全能性的標(biāo)志是細(xì)胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白10；（2）ES細(xì)胞具有無限增殖性，體外

7、培育能在未分化狀態(tài)下無限增值；（3）ES細(xì)胞具有種系傳遞功能；（4）ES細(xì)胞易于進(jìn)行基因改造操作；（5）ES細(xì)胞保留了正常二倍體的性質(zhì)且核型正常；（6）ES細(xì)胞能參加胚胎各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育，獲得包括生殖系在內(nèi)的后代；（7）ES細(xì)胞多數(shù)處在細(xì)胞周期的S期，缺少G1期檢測(cè)點(diǎn)；（8）在雌性哺乳動(dòng)物的每個(gè)體細(xì)胞內(nèi)，2個(gè)X染色體中的一個(gè)會(huì)永久失活，X失活不發(fā)生于未分化的ES細(xì)胞11,12。2.2 胚胎干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征 ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相像的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞體積小，核大，核質(zhì)比高，有一個(gè)或多個(gè)明顯的核仁，核型正常，具有整倍性。在體外分化抑制性生長(zhǎng)時(shí)，ES細(xì)胞呈克隆狀生長(zhǎng)，排列緊密，呈鳥巢集落狀

8、，難以看清細(xì)胞界限，集落邊界清晰，有立體感 用堿性磷酸酶染色，ES細(xì)胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細(xì)胞呈淡黃色，小鼠ES細(xì)胞的直徑為7 18 m，豬牛羊ES細(xì)胞的顏色較深，直徑為12 18m 13。3 胚胎干細(xì)胞的分離與培育3.1 胚胎干細(xì)胞的建系 ES細(xì)胞建系，來自由分離的內(nèi)細(xì)胞群細(xì)胞從5 9周的胚胎生殖腺中分離ES細(xì)胞，也用克隆技術(shù)將體細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，使之發(fā)育成囊胚， 再分離其內(nèi)細(xì)胞群細(xì)胞，由這種方法獲得的細(xì)胞或組織，遺傳物質(zhì)和供體全都，故移植后不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。Hwang等14應(yīng)用這種方法獲得了胚胎干細(xì)胞1981年，Evans等首先建立了小鼠的ES細(xì)胞系，在此之后近20年里，

9、人們相繼自早期胚胎建立了倉鼠、豬、兔、水貂、大鼠、魚類、鳥類、牛等靈長(zhǎng)類動(dòng)物( 恒河猴狨) 和人的類ES細(xì)胞系，從PGCs分離克隆到小鼠EG細(xì)胞系后，人們分別自PGCs分離克隆到人山羊雞等類ES細(xì)胞15。3.2 胚胎干細(xì)胞的體外培育3.2.1培育基成分需要特別的培育液，由于胚胎干細(xì)胞來源于分裂增殖的早期胚胎細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)要充足以維持其生長(zhǎng)代謝。因此，需要含糖量高營(yíng)養(yǎng)豐富的高糖型DMEM培育基以供應(yīng)飼養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的能量，同時(shí)又能提高胚胎干細(xì)胞的增殖速度。3.2.2飼養(yǎng)層細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞能向培育液中分泌多種細(xì)胞因子供應(yīng)胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境和信號(hào)，通過細(xì)胞接觸機(jī)制和非接觸機(jī)制，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖并阻止

10、其分化飼養(yǎng)層細(xì)胞的來源，可以是人或胚鼠的成纖維細(xì)胞。3.2.3細(xì)胞因子 很多細(xì)胞因子有促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制其分化的作用，需要加入白血病抑制因子抑制分化。4 胚胎干細(xì)胞的鑒定4.1 形態(tài)學(xué)鑒定胚胎干細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與早期胚胎細(xì)胞相像，細(xì)胞體積小，核質(zhì)比高，細(xì)胞核顯著，核內(nèi)有一個(gè)或多個(gè)核仁，細(xì)胞之間界限不清晰，緊密聚集呈鳥巢狀。4.2 生長(zhǎng)特性鑒定ES細(xì)胞在體外分化抑制培育時(shí)，有集群生長(zhǎng)的趨勢(shì)，呈集落狀生長(zhǎng)，細(xì)胞積累密集，集落周邊整齊，與飼養(yǎng)層界限分明且色澤深亮，有時(shí)會(huì)有單個(gè)ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。但不同物種、不同類型的ES細(xì)胞的特征又有所不同。 如小鼠ES細(xì)胞直徑一般為1214m，ES

11、細(xì)胞集落表面細(xì)胞層次分明，以環(huán)狀形式排列，呈典型的“鳥巢狀”；牛的為1119m，豬的為1215m，兔的為912m，且它們的ES細(xì)胞集落呈“饅頭狀”。4.3 免疫學(xué)鑒定法堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP)：很多商量表明，AKP的高表達(dá)與未分化的多能干細(xì)胞相關(guān)，如哺乳動(dòng)物的桑葚胚和早期囊胚堿性磷酸酶呈陽性，并且在桑葚胚和胚泡細(xì)胞中均有AKP的表達(dá)，ES細(xì)胞中也都含有豐富的AKP，而在已分化的ES細(xì)胞中AKP呈弱陽性或陰性，因此，可以鑒定ES細(xì)胞是否分化16。5 胚胎干細(xì)胞的商量應(yīng)用5.1 胚胎干細(xì)胞在生物基礎(chǔ)上的應(yīng)用5.1.1胚胎干細(xì)胞作為外源基因?qū)氲闹匾荏w細(xì)胞之

12、一隨著功能基因組學(xué)商量的全面展開，利用胚胎干細(xì)胞建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的商量熱點(diǎn)在基因打靶上， 由于這種方法能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)氚屑?xì)胞染色體上某一特定部位或使某一基因發(fā)生定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)了外源基因的定點(diǎn)整合。5.1.2胚胎干細(xì)胞用于人體發(fā)育的細(xì)胞和分子機(jī)制的商量在哺乳動(dòng)物中， 由于在胚胎發(fā)生的重要時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量很少且細(xì)胞之間的關(guān)系極為簡(jiǎn)單分析單個(gè)信號(hào)的作用十分困難。 胚胎干細(xì)胞體外培育定向誘導(dǎo)分化體系的建立避開了這些障礙，將十分簡(jiǎn)單的問題簡(jiǎn)潔化為細(xì)胞及細(xì)胞外分化調(diào)節(jié)因子， 供應(yīng)一個(gè)相當(dāng)對(duì)單純的反應(yīng)環(huán)境，大大便利了人們對(duì)細(xì)胞分化及胚胎發(fā)育的分子機(jī)制的商量。5.1.3胚胎干細(xì)胞用于動(dòng)物生理機(jī)能調(diào)控的商量利用基因

13、定位技術(shù)破壞相關(guān)基因， 可以制備甲狀腺腎上腺卵巢胰腺功能紊亂的小鼠模型，以商量高血壓和繁殖功能與下丘腦-垂體分泌激素調(diào)節(jié)的關(guān)系。利用基因定位技術(shù)可以商量腫瘤的形成過程， 轉(zhuǎn)基因小鼠可用于商量腫瘤的形成過程近交系小鼠腫瘤發(fā)生過程的特異性， 表明腫瘤發(fā)生具有遺傳性。利用基于定位技術(shù)商量激素與掌握生物發(fā)育基因的關(guān)系，用細(xì)胞遺傳操作技術(shù)增加或刪除掌握發(fā)育的基因制備基因缺失型小鼠， 觀測(cè)這種小鼠的表現(xiàn)以及對(duì)有關(guān)激素作用的反應(yīng)。5.2 人類胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用人類ES細(xì)胞的臨床應(yīng)用，既是將人類ES細(xì)胞進(jìn)行肯定程度的克隆，用于治愈疾病。而治療性克隆，始終是世界上爭(zhēng)議的話題，英國(guó)、日本、中國(guó)、韓國(guó)等支持治療性

14、克隆，認(rèn)為這是社會(huì)的進(jìn)步；而美國(guó)、德國(guó)等始終反對(duì)對(duì)人類胚胎進(jìn)行的任何克隆。2010年10月，美國(guó)杰龍生物醫(yī)藥公司培植的GRNOPC1人類ES細(xì)胞已在佐治亞州亞特蘭大“牧者中心”醫(yī)院展開全球首宗人類胚胎干細(xì)胞治療的人體臨床試驗(yàn)，以評(píng)估GRNOPC1人體ES細(xì)胞用在治療脊髓損傷方面的平安性與耐受性。2010年11月，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）同意美國(guó)先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司可以實(shí)施使用閑置的試管嬰兒的ES細(xì)胞治療遺傳性眼病的臨床試驗(yàn)。2011年7月，該公司正式進(jìn)行了首例以人類ES細(xì)胞醫(yī)治漸進(jìn)式失明患者的手術(shù)。早期跡象顯示，患者在手術(shù)過程中適應(yīng)良好。2011年9月，英國(guó)藥品監(jiān)管部門于批準(zhǔn)美國(guó)馬薩諸塞州的

15、先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司開展人類ES細(xì)胞試驗(yàn)。該公司今后將利用人類ES細(xì)胞就青少年失明展開臨床試驗(yàn)。這是歐洲首次批準(zhǔn)人類胚胎干細(xì)胞臨床試驗(yàn)。5.3 胚胎干細(xì)胞在生產(chǎn)上的應(yīng)用由于胚胎干細(xì)胞可以作為外源基因的受體， 所以人們可以利用它來生產(chǎn)一些攜帶有特別功能基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法有兩種：胚胎嵌合法將肯定數(shù)量的轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞注射入囊胚或裸胚共同培育生成嵌合胚， 再將嵌合胚移植入同期發(fā)育的受體母畜子宮使其產(chǎn)下嵌合體動(dòng)物，然后相互交配通過有性生殖生產(chǎn)純合基因型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 細(xì)胞核移植法以攜帶有外源基因的胚胎干細(xì)胞作核供體進(jìn)行核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎， 通過胚胎移植將轉(zhuǎn)基因胚胎移植給受體母畜即可生

16、產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物， 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物攜帶的外源基因在世代交替過程中能逐代傳遞。6 目前存在的問題及展望在ES細(xì)胞的商量中，仍然存在著很多問題，如誘導(dǎo)分化效率低定向細(xì)胞分離和純化困難培育條件滯后定向分化的機(jī)制臨床應(yīng)用與轉(zhuǎn)基因的平安性交叉污染免疫排斥等。除這些外，由于ESC涉及早期胚胎，因此由涉及的倫理社會(huì)法律醫(yī)學(xué)神學(xué)和道德等爭(zhēng)議也限制了當(dāng)前hES細(xì)胞的進(jìn)展，不得不引起重視17。近年來的商量顯示，體細(xì)胞在四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4 Klf-4Sox-2和c-Myc的作用下可以重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞( induced pluripotent stem cells，iPSC)，由于人iPSC 可以較容易地由個(gè)體自身

17、的體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)獲得，同時(shí)避開倫理方面的問題，因此，iPSC 被認(rèn)為是替代ESC的良好材料，為了提高iPS 細(xì)胞技術(shù)的效率及平安性，商量圍圍著篩選標(biāo)記載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的種類體細(xì)胞類型和一些可以促進(jìn)效率提高的化合物篩選等展開，目前進(jìn)展很快。但是，iPS 細(xì)胞也存在很多謎團(tuán)，如iPS 細(xì)胞其體細(xì)胞特異的基因是否完全沉默重編程的結(jié)果差異和危險(xiǎn)性等18盼望隨著科技的進(jìn)展，科學(xué)家們能間續(xù)解答這些謎團(tuán)，讓ESC和iPS 更好的造福于人類。參考文獻(xiàn)1 陳展睿胚胎干細(xì)胞的商量進(jìn)展J現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12( 26) :5186-5188. 2 Sun Yan. New Milestone in the

18、development of Clinical Oncology-Molecular Targeted Therapy J. Anti-tumor Pharmacy, 2011, 1(1):1-5.3 Evans M J, Kaufman M H. Establishment on culture of pluripotential cells frommouse embryos J. Nature, 1981, 292:154.4 Evans M J, NoLarianni E, LaurieS, et al. Derivation and preliminary characterizal

19、ion of pluripotent cell lines fro mporcine and bovine blastocysts J.Theri ogenology ,1990(1)：125-128.5 Strojek R M. Reed M A, Hoover J L, et al. Amethod for cultivating morphologically undifferentiate dembryonic stem cells fro mporcine blastocysts J.Theri onenolony,1990(4) 901-913.6 Matsui Y, ZsehoK

20、, Hogan B L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murineprimordial germ cells in culture J. Cell, 1992, 70: 841-847.7 Robert A. Stralegies for the isolation and characlerization of bovine embryonic stem cells J. Reprod fertiledev, 1994, (6):569-575.8 Thomson J A, Kalishmen J, Golos

21、T G, et al. Isolation of a primate embryomic stem cell line. Proceeding softhe National Academyof sciences. USA,1995, 92:7844-7848.9 徐 蘭，李 斌 人胚胎干細(xì)胞建系和培育的商量進(jìn)展J 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12( 32) :6393-6398.10 周作民. 人胚胎干細(xì)胞商量進(jìn)展 J. 生殖與避孕, 2004, 24(5):I-III.11 Thomson J A, ltskovitz-Eldor J , Shapiro S S, et al. Blast

22、ocysts embryonic stem cell lines derived from human J . Science, 1998, 282(1145):1145-1151.12Nakamura K, Aizawa K, Yamauchi J, et al. Cell Prolif. Hyperforin inhibits cell proliferation and differentiation in mouse embryonic stem cells J. Cell Prolif, 2013, 46( 5) :529-537.13 Evans MJ, Kaufman M H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos J. Nature, 1981, 292(5819):154-160.14 Hwang W S, Ryu Y J, Park J H, et al. Evidence of a pluripotent Human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocystJ. Science, 2004,