大豆異黃酮大孔樹脂吸附分離性能的研究設(shè)計(jì)

1、豆粕中大豆異黃酮大孔樹脂吸附分離性能的研究大豆異黃酮（Soy isoflavone)是以大豆油渣為原料,經(jīng)過提取分離,加工成含量達(dá)30%-95%的粉狀大豆異黃酮。近年來研究表明大豆異黃酮具有廣泛的生理活性, 除其自身作為異黃酮具有的抗氧化作用外,大豆異黃酮作為雌性激素治療的替代品,可以改善婦女更年期綜合癥；其對與激素有關(guān)的腫瘤如乳腺癌和前列腺癌的抑制作用更為顯著受到極大關(guān)注；此外,大豆異黃酮在治療和預(yù)防心腦血管疾病方面也有明顯作用。大豆異黃酮已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。大豆異黃酮是多酚類混合物,分為游離型的甙元(Aglycon)和結(jié)合型的糖甙(Glucosides)兩類。甙元包括染料木素(

2、Genistein)、大豆黃素(Daidzein)和黃豆黃素(Glycitein)。天然情況下它們主要以-葡萄糖甙形式存在,即染料木甙(Genistin)、大豆黃甙(Daidzin)和黃素黃甙(Glystin),部分異黃酮甙發(fā)生乙?；?、丙二?；?但所有這些大豆異黃酮衍生物經(jīng)酸水解或酶催化分解后都能轉(zhuǎn)化為大豆異黃酮甙元。大豆異黃酮所具有的良好的藥理作用顯示了它具有很大的開發(fā)價(jià)值,通過提取分離大豆異黃酮能充分合理利用大豆中的各種有效成分,提高其附加值,實(shí)現(xiàn)良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。目前有關(guān)豆粕的提取工藝主要以乙醇為提取溶劑，由于乙醇系有機(jī)溶劑，消耗大、成本高、且生產(chǎn)過程存在易燃等安全隱患，為此我們

3、根據(jù)豆粕異黃酮有一定的水溶性，試改用水做提取溶劑，以大豆異黃酮為目標(biāo)，對其大豆異黃酮進(jìn)行了正交提取工藝研究，并對最佳提取工藝得到的提取液進(jìn)行了大孔吸附樹脂吸附分離性能研究，以期為豆粕大豆異黃酮的開發(fā)利用提供依據(jù)。1 材料與儀器1.1 材料 豆粕(采自陜西石羊公司)，自然干燥，粉碎。1.2 試劑 染料木素和大豆黃素對照品:百靈威化學(xué)；大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制檢定所1502-2001O1)。大孔樹脂ADS-21、ADS-7、D101，AB-8購自西安藍(lán)小科技開發(fā)有限公司。甲醇:色譜純試劑，其余試劑均為分析純。1.3 儀器 天津市泰斯特儀器有限公司FZ102植物粉碎機(jī)；德Sartorius賽多

4、利斯ME235S-電子分析天平；上海亞榮生化儀器廠RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；上海醫(yī)療器械五廠H·H·S21-6C電熱恒溫水浴鍋；江蘇昆山超聲儀器公司KQ-50DB 超聲清洗器；鄭州長城科工貿(mào)有限公司SHB-C循環(huán)水式多用真空泵；日本島津LC-20A型高效液相色譜系統(tǒng)(包括SPD-20A檢測器、LC-20A型高壓恒流泵和LC Solution工作站)；色譜柱:Inertsil C18（4.6mm×250mm，5m）；日本島津UV-1700紫外可見分光光度計(jì)；日本島津CS930型薄層色譜掃描儀；日本島津ZF1型三用紫外分光儀；上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠101A2型鼓風(fēng)干燥箱；

5、浙江黃巖求精真空泵廠2XZ-2旋片式真空泵；北京醫(yī)用離心機(jī)廠LD5-10高速離心機(jī)；上海悅豐DE-10蒸餾水器；美國Bedford公司Milli-Q超純水制備儀；TGL-16C型高速離心機(jī) ；上海滬西分析儀器廠有限公司HL-2恒流泵；上海大龍醫(yī)療器械有限公司PotPette 100-1000l 手動(dòng)單道可調(diào)式移液器；索式提取器；層析柱(16 mm×30 cm)。2 方法2.1大豆異黃酮的薄層檢測大豆異黃酮苷元的薄層檢測硅膠薄板制作稱取4g硅膠GF254置于研缽中，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液12ml，研磨15min后鋪于20×10cm的干凈玻璃平板上，要求平整無氣泡，然

6、后晾干即可。展開劑配制取展開劑氯仿-無水甲醇10：0.5的比例配制52.5ml（50：2.5）作為展開劑。薄板活化：將制好的硅膠薄板在105下活化30min。點(diǎn)樣：點(diǎn)樣點(diǎn)距板子底端1.5cm左右，所有點(diǎn)樣點(diǎn)位于同一直線上，盡可能向中間靠攏，每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)點(diǎn)樣約20l，點(diǎn)樣點(diǎn)盡可能小。飽和：將板子不沒入層析缸內(nèi)的展層劑中，在展層劑的蒸氣中飽和約0.5h。層析：將板子下端插入展層劑中進(jìn)行展開，當(dāng)展層劑前沿距板子上端約1.5cm時(shí)取出板子，自然晾干。觀察：展開取出晾干后，在254nm熒光燈下觀察，斑點(diǎn)呈淺黃色。Rf 。2.2紫外分光光度法測定大豆異總黃酮2 2張玉梅，孫學(xué)斌，高旭年，等.紫外分光光度法測

7、定大豆異總黃酮的含量J.中國食品衛(wèi)生雜志.2000，12(4)7-9 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱取大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制檢定所1502-2001O1)2.0mg,置于25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻線，搖勻，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻線，搖勻，以甲醇為空自，在254nm的波長處測定A值，以濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.138X-0.0056，R2=0.9994，線性范圍(0.8-6.4 ml/L)。含量測定 精確量取供試品溶液0.01mL用無水甲醇稀釋

8、1000倍到10 mL定容，用TU-9100紫外分光光度計(jì)在波長254nm處測定A值3次，取平均值測定結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量。2.3紫外分光光度法測定大豆異總黃酮關(guān)于測定大豆異黃酮的含量有采用比色法、薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等，比色法干擾多，專一性差，測定結(jié)果偏差較大;薄層色譜法存在分離效果差，定量不準(zhǔn)確等不足;氣相色譜法需要將樣品進(jìn)行衍生，操作繁瑣，易受雜質(zhì)干擾;高效液相色譜法能檢測不同類型的異黃酮，但檢測時(shí)間較長，設(shè)備運(yùn)行費(fèi)用較高，不適于在提取工藝探討中大量多次地監(jiān)測異黃酮.大豆異黃酮為黃酮醇類化合物，在紫外光區(qū)有較強(qiáng)吸收，因此可采用適當(dāng)對照品，用紫外分光光度法檢測大

9、豆異黃酮含量9。 9楊曉文.大豆異黃酮測定力法的研究概況J.中國油脂.2006,31(1):60-62標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取120干燥至恒重的染料木素5mg置于5OmL容量瓶中，用95%乙醇溶解，并定容個(gè)刻度，搖勻、分別用移液管準(zhǔn)確吸取O.5mL,1.OmL,1.5mL, 2.OmL,2.5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于5OmL容量瓶中，并各加入95%乙醇1.Oml,再加蒸餾水稀釋個(gè)刻度，搖勻、以1 mL95%乙醇加水到5OmL作空白對照、在260nm處測吸光度，染料木素的濃度C以g/mL為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程A=0.1676X-0.0118，r=0.9982。樣品的制備 豆

10、粕多功能食品粉碎機(jī)粉碎后，過30目篩，稱取粉碎樣品5.OOOOg,、將無水乙醇配成70%濃度后取40mL，索氏提取豆粕粉末，在70恒溫水浴中提取2h,減壓抽濾去殘?jiān)?，回收溶劑至干，?5%乙醇溶解，定容至5OmL容量瓶中，作為儲(chǔ)備液、準(zhǔn)確吸取儲(chǔ)備液2mL置5OmL容量瓶中，加95%乙醇1.OmL定容個(gè)刻度，搖勻、作平行樣3份。序號吸光度含量(g/g)平均含量(g/g)RSD(%)10.6353118.9620.6373119.28118.591.030.6277117.532.4高效液相色譜法測定大豆異黃酮的含量儀器條件:Waters液相色譜儀;C18色譜柱，150mmX4.6mm, 5m;流

11、動(dòng)相:甲醇:水:磷酸=55:45:0.3;流速:0.6mL/min;柱溫:25;檢測波長:260nm。標(biāo)準(zhǔn)溶液:用十萬分之一電子天平準(zhǔn)確稱量5.Omg染料木素和5.Omg大豆黃素對照品，加入50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品預(yù)處理:因大豆異黃酮甙元容易得到純品，所以測定大豆異黃酮含量時(shí)都以甙元做對照品。這樣在進(jìn)行HPLC分析之前，需對大豆異黃酮樣品進(jìn)行預(yù)處理。準(zhǔn)確稱量5Omg待分析樣品于50mL錐形瓶中，加入3OmL甲醇和5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的鹽酸水溶液，在恒溫水浴鍋上80加熱回流水解1h至大豆異黃酮甙完全水解為大豆異黃酮甙元后，把水解液用甲醇定容至5OmL容量瓶中

12、，進(jìn)液相色譜進(jìn)行分析。樣品分析:以標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰保留時(shí)間和峰面積與溶液濃度的對應(yīng)工作曲線為依據(jù)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的相應(yīng)組分的換算系數(shù)計(jì)算樣品中總大豆異黃酮甙的含量。2.5 RP-HPLC測定大豆異黃酮的含量阮洪生，秦學(xué)功，陳志寶，等. 大孔吸附樹脂富集豆粕中大豆異黃酮的工藝研究J.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)2007，19（5）：72-76 采用RP-HPLC測定豆粕中以大豆苷和染料木苷為主的異黃酮含量。色譜條件為色譜柱:KromasilC18柱(4.6 mm X 250 mm, 5m);柱溫:30;流動(dòng)相:甲醇-水(3:7);流速:1.00 mL.min-1;檢測波長:260nm;進(jìn)樣量:10L。建立

13、測定大豆苷與染料木苷的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)表1吸附樹脂的物理性能型號極性比表面積/(m2/g)孔徑/nmADS-21ADS-7D101AB-8樹脂的處理和再生： 將樹脂放入蒸餾水中，溶脹后浮選，用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用蒸餾水洗至中性，然后用0.5moL/L的HCl溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至中性。用95%乙醇浸泡24h，不斷攪拌，用蒸餾水洗至無白色混濁，并且無醇味。用蒸餾水浸泡待用。樹脂簡單再生可用含量為95%的乙醇洗至無色，即可使用，經(jīng)多次使用的樹脂吸附雜質(zhì)較多，顏色較深，可用酸堿處理再生后使用。豆粕樣液制備稱取粉碎后豆粕100g，加600ml 75%酒精

14、于60熱回流提取120min，用4層紗布粗濾得粗濾液，殘?jiān)偌尤?00ml75%酒精于60熱回流提取90min，用4層紗布粗濾得粗濾液，殘?jiān)偌尤?00ml75%酒精于60熱回流提取90min，用4層紗布粗濾得粗濾液，合并三次粗濾液，在用濾紙或離心過濾得豆粕提取液。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/5，再加入和濃縮液同體積的蒸餾水水，繼續(xù)蒸餾至餾出液中乙醇含量為10%時(shí)停止。調(diào)pH為4,使蛋白析出，離心l5min，倒出上清液，再將pH調(diào)到中性，得到豆粕大豆異黃酮溶液（ mg/ml）。 飽和吸附量的測定準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的用濾紙吸干表面水分的樹脂1.00 g于100 ml三角瓶中，精密加入 mg

15、/ml的豆粕大豆異黃酮溶液20.0 ml，在25，120 r/min的條件下振蕩吸附18-24 h。測定吸附后溶液中大豆異黃酮的量，并按下式計(jì)算樹脂的飽和吸附量。飽和吸附量=(加入的大豆異黃酮-未吸附的大豆異黃酮)/ 樹脂的量。 樹脂脫附率的測定將上述經(jīng)過24 h靜態(tài)吸附大豆異黃酮的樹脂分離出來，吸干表面水分，然后加入75%的乙醇20.0 ml，在25，120 r/min的條件下振蕩脫附2 h。測定脫附液中大豆異黃酮的量，按下式計(jì)算脫附率。脫附率(%)=洗脫出的大豆異黃酮/(加入的大豆異黃酮-未吸附的大豆異黃酮)×100%。不同樹脂對大豆異黃酮的吸附量和解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 。表 大孔樹

16、脂靜態(tài)吸附及解吸性能型號吸附量/(mg/g)解吸率/% ADS-21ADS-7D101AB-8從表 可看到4種樹脂中 樹脂的吸附量最大， 最小，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，對樹脂要求不僅要求吸附量大，而且要求解吸率要高，以保證有效成分的最大回收。在這2種樹脂中 樹脂不僅具有大的吸附量，而且具有較高的解吸率，因此認(rèn)為 樹脂是富集純化大豆異黃酮較為理想的吸附材料。吸附樹脂ADS-22ADS-7ADS-16ADS-8ADS-F8ADS-17功能基的性質(zhì)酰胺胺基酰胺非極性胺基羰基比表面積(m2/g)30120504501110所得提取物的大豆異黃酮含量與樹脂的選擇性有關(guān)。從圖1可以看出，由含胺基、酰胺基的ADS

17、-22, ADS-7, ADS-16, ADS-F8得到的提取物中，大豆異黃酮含量都較高;而由含羧基的ADS-17和非極性樹脂ADS-8得到的提取物中，大豆異黃酮的含量都較低。這說明大豆異黃酮提取物的含量是由樹脂的功能基所決定的，含N基團(tuán)的樹脂對含酚輕基的大豆異黃酮的吸附選擇性較高，所以用ADS-22, ADS-7, ADS-16, ADS-F8樹脂可以得到較高含量的大豆異黃酮提取物。其ADS-22的綜合性能最好，故選此種樹脂進(jìn)行以下的試驗(yàn)。大孔吸附樹脂解吸特性的考察按項(xiàng)的方法得到吸附飽和的 樹脂5份,分別精確加入20 mL的15%、30%、45%、60%和75%的乙醇溶液進(jìn)行解吸,計(jì)算不同濃

18、度乙醇溶液對大豆異黃酮的解吸率。選擇洗脫劑不僅要求具有使大孔樹脂溶脹，減弱被吸附物質(zhì)與樹脂之間的吸附力，而且要求可溶解被吸附物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)選用洗脫劑為乙醇，考察不同乙醇溶液濃度對大豆異黃酮的解吸效果,結(jié)果見圖1。洗脫劑濃度15%30%45%60%75%解吸率%將表做圖圖洗脫劑濃度對大豆異黃酮解吸的影響由圖 可以看出，15%和30%的洗脫液解吸率較低，而60%的洗脫液基本上可以將大豆異黃酮完全從樹脂上解吸下來，從純化的純度角度和節(jié)約試劑用量的角度考慮，應(yīng)選用60%乙醇作為洗脫劑，沒有必要使用75%的乙醇作為洗脫劑。2.3.6 pH對樹脂吸附效果的影響準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的用濾紙吸干表面水份的濕樹脂 5

19、份，每份1.0 g，裝入50mL具塞錐形瓶中，分別加入用2mol/L的鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值的溶液20mL，在搖床上振搖18-24 h，測定吸附后溶液中大豆異黃酮的量。pH值3.54.55.56.57.5吸附量將表做圖由圖 可以看出, pH值在4.5-5.5之間,樹脂對大豆異黃酮的吸附量是最大的,因?yàn)槎蛊牲S酮類化合物分子中含有酚羥基、羧基,呈弱酸性,酸性化合物在酸性溶液中易吸附;此外,酸性條件下有利于葡萄糖苷型異黃酮水解成苷元型,更容易被樹脂所吸附。酸性太強(qiáng),樹脂的吸附性能會(huì)受到影響,吸附率下降;堿性增強(qiáng),會(huì)使異黃酮的親水性增強(qiáng),從而使吸附量下降。2.4 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)吸附透過曲線的測定吸附材料選取 樹脂，采用16 mm×300 mm的玻璃層析柱作為吸附柱，稱取預(yù)處理好的樹脂20 g，濕法裝柱，取豆粕樣液（ g/ml）300mL，用2mol/L的鹽酸將黃酮供試液調(diào)pH值為 進(jìn)行上樣，上樣流速控制在23 mL/min，每50 mL接一管，測定流出液中大豆異黃酮濃度,繪制動(dòng)態(tài)吸附透過曲線。流出液體積ml50100150200250