大果山楂黃酮提取物對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用

1、大果山楂黃酮提取物對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用    【摘要】  目的研究大果山楂黃酮提取物對大鼠實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷、肝纖維化的預(yù)防作用，并探討其作用機(jī)制。方法采用40 CCl4皮下注射制備肝纖維化大鼠模型，分別用3種不同濃度的大果山楂黃酮提取物進(jìn)行干預(yù)，觀察檢測大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清白蛋白與血清球蛋白的比值、肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量以及肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果大果山楂黃酮提取物預(yù)防給藥能降低CCl4所致大鼠血清中異常增高的ALT，AST； 升高CCl4所致大鼠血清中異常降低

2、的A/G比值；大果山楂黃酮提取物預(yù)防給藥能使肝損傷大鼠肝勻漿異常降低的SOD含量上升，異常增高的MDA含量下降；光鏡下觀察肝纖維化模型組大鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重變性、壞死，膠原纖維明顯增加，大果山楂黃酮提取物預(yù)防各組大鼠肝細(xì)胞病理損傷得到明顯改善。結(jié)論大果山楂黃酮提取物對大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有一定程度的預(yù)防作用和抗肝纖維化作用。 【關(guān)鍵詞】  大果山楂黃酮提取物 肝纖維化 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 谷草轉(zhuǎn)氨酶 白蛋白 球蛋白 超氧化物歧化酶 丙二醛Abstract:ObjectiveTo study the anti-hepatofibrotic effect of the  Malus doume

3、ri(Bois)Chev. flavonoids extraction  on experimental hepatic fibrosis and its mechanism.MethodsThe hepatic fibrosis rat model was developed by subcutaneous injection of 40CCl4 (5 ml/kg) and rats were treated with extract of Mdf at 1.5g/（kg?d）, 0.75/（kg?d） or 0.38/（kg?d）. Alanine aminotransferas

4、e(ALT),aspartate aminotransferase(AST),Albumin(A),globulin(G)levels were measured and pathological changes after of liver tissue was examined HE staining.ResultsThe extract of Mdf  could reduce the serums  levels of ALT and AST, increase the hepatic ratio of A/G,increase the activity of su

5、peroxide dismutase and reduce  the level malondialdehyde Examined by light microscope，the degeneration and necrosis level of hepatocytes and the distribution of collagen fibrosis were markedly increased in the model group. The extract of Molf could significantly alleviate pathological changes a

6、nd the collagen fibrosis.ConclusionThe extract of Mdf can protect hepatocytes from injury and prevent the progression of hepatic fibrosis in rats.Key words:Malus doumeri(Bois)Chev. flavonoids extraction;  Hepatic fibrosis;  Alanine Aminotransferase;  Aspartate Aminotransferase; 

7、Albumin;  Globulin；  Superoxide dismutase；  Malondialdehyde    大果山楂為薔薇科青蘋果屬臺灣林檎的干燥成熟果實(shí),  性味甘、酸、澀、微溫,有理氣健脾、消食導(dǎo)滯之功效,在廣西作為山楂習(xí)用已有八十多年的歷史,已知其化學(xué)成分有維生素、鞣質(zhì)、萜類、苷類、黃酮類、酚類和微量元素,其中黃酮含量豐富,是中藥山楂的2倍多1。已知某些黃酮類成分具有很好的保肝作用,因此本文從保肝的角度，研究了大果山楂黃酮提取物對大鼠實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷、肝纖維化的預(yù)防作用，觀察了大果山楂黃酮提取物對CC

8、l4誘發(fā)大鼠實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷、肝纖維化的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。1  器材與方法1.1  動物Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重(180±20) g,由廣西中醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供,桂醫(yī)動字第11004號。1.2  試劑與藥品大果山楂Malus domeri(Bois)Chev.,購自廣西賀州，經(jīng)廣西區(qū)藥品檢驗(yàn)所黃燮才專家鑒定為薔薇科蘋果屬植物臺灣林檎的干燥成熟果實(shí)；大果山楂總黃酮提取物，自行提取。四氯化碳(CCl4)淮南化學(xué)試劑。臨用前以花生油調(diào)和按體積比配成40 CCl4溶液。秋水仙堿，由云南西雙版納制藥廠生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H53021369。將

9、秋水仙堿片研碎用蒸餾水配成0.02 mg/ml混懸液，用作陽性對照藥物。ALT試劑盒、AST試劑盒、白蛋白試劑盒、總蛋白試劑盒，伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號分別為060305，060407，060503，060517。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測試盒,南京建成生物工程研究所產(chǎn)品,批號20060701。1.3  儀器JY9222D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所);UV22100分光光度計(jì)(日本島津);電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠生產(chǎn))。1.4  方法2Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重(180±20) g，隨機(jī)分為6組：空白對照組(

10、10只) ，肝纖維化模型對照組(10只)，秋水仙堿陽性對照組(10只)，大果山楂總黃酮提取物預(yù)防低、中、高劑量組各10只。普食普水飼養(yǎng)1周后開始造模，除空白對照組外其余各組以40 CCl4花生油溶液腹部皮下注射，首次  5 ml/kg，以后3 ml/kg，2次/周，連續(xù)注射8周。造模前兩天開始灌胃給藥或蒸餾水，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，1次/d，劑量為：空白組和模型組灌以蒸餾水10 ml/(kg?d)；秋水仙組灌以秋水仙堿0.2 g/(kg?d)；大果山楂總黃酮提取物預(yù)防低、中、高劑量組分別灌以大果山楂總黃酮提取物1.5,0.75, 0.38 g/(kg?d)，逐日觀察大鼠活動、進(jìn)食量、毛

11、色等情況。8周末各組大鼠于末次灌胃24 h后取材、處死。每只大鼠摘眼球法取血約3 ml，裝入預(yù)先滴有肝素50 l的EP管中，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，賴氏法測定血清ALT，AST，測SOD，MDA。取血完畢后處死大鼠，立刻剖開腹腔，暴露肝臟，取肝右中央葉約0.5 cm3，迅速投入10福爾馬林溶液中固定。石蠟包埋，制備病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理變化。肝組織病理學(xué)改變分為4級：正常肝組織為“”；肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，炎細(xì)胞浸潤，散在的肝細(xì)胞脂肪變性為“”；纖維組織增生向肝組織小葉內(nèi)延伸“”；肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生，橋接壞死，早期肝壞死為“

12、”3。百事通1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS11.5計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較用Ridit檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較用t'檢驗(yàn)。2  結(jié)果2.1  大鼠一般情況在實(shí)驗(yàn)過程中，空白組大鼠體重自然增加，行動敏捷，食欲正常，皮毛密集而有光澤；模型組大鼠精神萎靡，倦臥少動，或易激惹，皮毛干澀，蓬松少華，食欲欠佳，體重增長緩慢或不增長，尤以雌性大鼠明顯，大果山楂總黃酮提取物用藥預(yù)防各組精神、毛色及進(jìn)食量均好于模型組。2.2  大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和白蛋白與球蛋白比值的變化模型組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量

13、均有明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。大果山楂總黃酮提取物預(yù)防組的低、中、高劑量組血清ALT，AST含量均低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01和P<0.001)。模型組大鼠血清白蛋白與球蛋白比值明顯降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，大果山楂總黃酮提取物預(yù)防組的低、中、高劑量組血清白蛋白與球蛋白比值均高于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)。結(jié)果見表1。表1  大果山楂提取物對實(shí)驗(yàn)大鼠肝功能的影響(略 )2.3  大鼠肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD

14、)和丙二醛(MDA)含量模型組大鼠肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)含量顯著降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，大果山楂總黃酮提取物預(yù)防組的低、中、高劑量組大鼠肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)含量均高于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01和P<0.05)；模型組大鼠肝組織勻漿丙二醛(MDA)含量顯著升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，大果山楂總黃酮提取物預(yù)防組的低、中、高劑量組大鼠肝組織勻漿丙二醛(MDA)含量含量均低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01和P<0.001)。結(jié)果見表2。表2&

15、#160; 大果山楂提取物對實(shí)驗(yàn)大鼠肝勻漿SOD及MDA 的影響(略 )2.4  大鼠慢性肝損傷肝臟組織病理情況結(jié)果見表3。2.5  大鼠肝臟病理變化空白組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞無變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生。模型組多數(shù)肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞變性壞死明顯，表現(xiàn)為脂肪變性和細(xì)胞水腫，伴有程度不等、范圍不一的肝細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)擴(kuò)大，有粗細(xì)不均的纖維束從匯管區(qū)伸出，纖維組織增生，提示造模成功。秋水仙堿組可見程度不等、范圍不一的肝細(xì)胞壞死區(qū)及變性的肝細(xì)胞，以脂肪變性為主，可見少量正常肝細(xì)胞。提示秋水仙堿有預(yù)防肝纖維化的作用。大果山楂總黃酮

16、提取物各劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，纖維組織增生明顯減輕，脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤減少。結(jié)果見表3。表3  大果山楂提取物對實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟病理分級的影響（略）3  討論CCl4是制作肝損傷動物模型的常用藥物,通過肝微粒體中的細(xì)胞色素P450代謝激活后生成的自由基具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過氧化的作用2，最終導(dǎo)致生物膜破壞，肝細(xì)胞壞死。由于肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞膜通透性增加，ALT，  AST大量滲入血液，而使血中酶活性增高。所以血清中這兩種轉(zhuǎn)氨酶活性的增高在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度。慢性肝損傷主要表現(xiàn)為血清白蛋白下降，球蛋白增加，白蛋白與球蛋白的比例倒置；血清ALB

17、，GIB及A/G與肝組織病理分級及纖維化分期均有相關(guān)性4。SOD是細(xì)胞內(nèi)天然的氧自由基清除劑,而MDA則是氧自由基與細(xì)胞膜表面不飽和脂肪酸反應(yīng)(脂質(zhì)過氧化反應(yīng))的產(chǎn)物；大鼠腹腔注射CCl4導(dǎo)致慢性肝損傷時(shí)，過量的氧自由基產(chǎn)生于肝組織細(xì)胞并對其發(fā)生損傷時(shí)，會引起SOD水平下降，MDA含量升高3。慢性肝損傷時(shí)，氧化應(yīng)激,特別是脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞因子的生成導(dǎo)致肝星形細(xì)胞活化和增殖，活化的肝星形細(xì)胞合成分泌大量以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積，引起肝臟纖維化。在本實(shí)驗(yàn)研究中，大果山楂總黃酮提取物預(yù)防用藥可以有效地保護(hù)CCl4給藥后大鼠肝臟細(xì)胞，使肝臟細(xì)胞損傷程度降低，表現(xiàn)為給予CCl4和大果山楂總黃酮提取物的各組大鼠血清ALT，AST水平低于模型組，血清白蛋白與血清球蛋白的比值高于模型組；纖維組織增生、脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤低于模型組說明大果山楂總黃酮提取物對CCl4導(dǎo)致的大鼠慢性肝損傷具有良好的預(yù)防保護(hù)作用。同時(shí)，給予CCl4和大果山楂總黃酮提取物的各組大鼠的肝臟組織勻漿丙二醛(MDA)含量低于模型組、超氧化物歧化酶(SOD)含量含量高于模型組，提示大果山楂總黃酮提取物對CCl4導(dǎo)致的大鼠慢性肝損傷的保