PCR法支原體檢測(cè)

1、PCR法支原體測(cè)定PROTOCOL關(guān)鍵詞PCR、支原體修訂記錄姓名部門/職務(wù)簽名日期年-月-日起草人審核人批準(zhǔn)人生效日期年-月-日 有效期至年-月-日 分發(fā)部門：質(zhì)量部 1 / 81.目的標(biāo)準(zhǔn)PCR法支原體檢測(cè)的操作方法。2.范圍適用于工程研發(fā)過(guò)程樣品、原液、成品及中間體的分析。3.責(zé)任質(zhì)量分析人員熟悉并遵守該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。4.定義N/A5.設(shè)備、材料和試劑5.1設(shè)備、材料設(shè)備名生產(chǎn)商型號(hào)/貨號(hào)備注PCR儀ThermoARKTIK5020N/AVORTEXIKAGENIUS 3N/A小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)ThermoHERAEUS Fresco 21N/A單道移液器(10ul,20ul,100ul

2、)EppendorfResearch plusN/A多功能水平電泳槽TanonHE-120N/A凝膠成像系統(tǒng)BIORADChemiDoc XRS+ SystemN/A5.2試劑試劑名稱生產(chǎn)商貨號(hào)TaKaRa PCR Mycoplasma Detection SetTaKaRa6601TaKaRa Ex Taq®TaKaRaRR001ARegular Agarose G-10BiowestN/AGoldview國(guó)產(chǎn)N/A10×Loading BufferTaKaRa9157DL5000 DNA MarkerTaKaRa3428A內(nèi)毒素檢查用水廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠6.溶液配制6.1

3、 50× TAE Buffer稱取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA·2H2O于1L燒杯中，向燒杯中參加約800ml超純水，充分混勻，參加57.1ml冰乙酸，充分溶解，參加超純水定容至1L，室溫保存。有效期6個(gè)月。6.2 1× TAE Buffer量取10ml 50× TAE Buffer，參加490ml超純水，充分混勻。有效期6個(gè)月。7.操作步驟 用于檢測(cè)支原體的樣品是接種后進(jìn)行3-6天細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液。如果使用常用的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)上清可直接參加到PCR反響液中，如果使用細(xì)胞懸濁液作為樣品，那么需要提取DNA，再進(jìn)行PCR反響。

4、如果樣品中含有PCR反響阻礙物，需要對(duì)DNA進(jìn)行抽提，再添加到PCR反響液中，為了確認(rèn)樣品中是否含有反響阻礙物，在樣品中參加Control Template進(jìn)行正對(duì)照反響。7.1 1st PCR反響7.1.1按下表順序配制反響混合液50ul體系試劑用量ul內(nèi)毒素檢查用水37.7538.7510× PCR Buffer5dNTP Mixture4MCGp F1 Primer0.5MCGp R1 Primer0.5TaKaRa Taq0.257.1.2向以上反響混合液中分別參加1ul陰性對(duì)照樣品內(nèi)毒素檢查用水，1ul供試品，1ul陽(yáng)性對(duì)照樣品(Control Template)和2ul供

5、試品陽(yáng)性對(duì)照1ul供試品+1ulControl Template)，添加樣品時(shí)務(wù)必防止交叉污染。為了防止交叉污染，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需分區(qū)域操作。在實(shí)驗(yàn)區(qū)域1完成PCR反響液配置后，先在該實(shí)驗(yàn)區(qū)域參加1ul內(nèi)毒素檢查用水陰性對(duì)照，再在實(shí)驗(yàn)區(qū)域2參加1ul供試品，最后在實(shí)驗(yàn)區(qū)域3參加1ul Control Template陽(yáng)性對(duì)照及“1ul供試品+1ul control Template供試品陽(yáng)性對(duì)照。7.1.3將反響管置于PCR儀中，設(shè)定以下反響條件進(jìn)行PCR反響。9430sec94 30sec55 2min 35 cycles72 1min72 5min7.2 2nd PCR反響7.2.1按下表順序配

6、制反響混合液試劑用量(ul)內(nèi)毒素檢查用水39.2510× PCR Buffer5dNTP Mixture4MCGp F2 Primer0.5MCGp R2 Primer0.5TaKaRa Taq0.257.2.2用內(nèi)毒素檢查用水將1st PCR反響產(chǎn)物稀釋100倍，取0.5ul參加以上反響混合液中。為了防止交叉污染，加樣時(shí)需分區(qū)域操作，具體加樣方式同7.1.2。7.2.3 將反響管置于PCR儀中，設(shè)定以下反響條件進(jìn)行PCR反響。9430sec94 30sec55 2min 30 cycles72 1min72 5min7.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析7.3.1 1%瓊脂糖凝膠的

7、制備稱取0.4g Regular Agarose G-10，參加約40ml 1× TAE Buffer大于40ml，置于微波爐中中高火加熱2min，搖勻，再加熱2min。稍微冷卻后參加1ul Goldview，振蕩搖勻，倒入膠槽中，冷卻30min左右直至凝固。取出制備完成的瓊脂糖凝膠置于多功能水平電泳槽中，參加1× TAE Buffer直至超過(guò)凝膠2mm左右。7.3.2 上樣取1st和2nd PCR產(chǎn)物各10ul，參加1.1ul 10×Loading Buffer，混勻后，取10ul上樣，用6ul DL5000 DNA Marker作為對(duì)照。7.3.3 電泳及分析

8、調(diào)節(jié)電壓120V，電泳1h。取出凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)，拍照并分析確認(rèn)擴(kuò)增片段的有無(wú)及片段大小。8.數(shù)據(jù)分析8.1 Control實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照，供試品陽(yáng)性對(duì)照本實(shí)驗(yàn)中以內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照樣品；以Control Template作為陽(yáng)性對(duì)照樣品；以“供試品+Control Template作為供試品陽(yáng)性對(duì)照樣品。使用Control Template時(shí)，F(xiàn)1和R1引物擴(kuò)增產(chǎn)物是810 bp見圖1，泳道5、6，F(xiàn)2和R2引物擴(kuò)增產(chǎn)物是590 bp見圖1，泳道11、12。當(dāng)陰性對(duì)照結(jié)果呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果呈陽(yáng)性，此反響系統(tǒng)可行。當(dāng)供試品陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果呈陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品對(duì)PCR反響無(wú)阻礙

9、；如果供試品陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果呈陰性，說(shuō)明檢測(cè)樣品中有阻礙物，建議將檢測(cè)樣品進(jìn)行DNA提取，再以其作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 圖1 1、DL5000 Marker；2、H2O-1(1st)；3、H2O-2 (1st)；4、待測(cè)樣品；5、待測(cè)樣品+control(1st)；6、control(1st)；7、H2O-3 (1st)；8、H2O-1(2nd)；9、H2O-2 (2nd)；10、待測(cè)樣品(2nd)；11、待測(cè)樣品+control(2nd)；12、control(2nd)；13、H2O-3 (2nd)8.2 供試品檢測(cè)假設(shè)待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)呈陰性，

10、說(shuō)明無(wú)支原體污染，假設(shè)待測(cè)樣品有條帶，那么進(jìn)一步確認(rèn)片段大小。表1是以12種Mycoplasma DNA分別作為模板，2對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增所得到的片段大小。圖2是12種Mycoplasma DNA，取1ng進(jìn)行兩輪PCR反響反響體積為100ul后的電泳結(jié)果。表1 12種Mycoplasma屬的擴(kuò)增片段大小圖2 12種Mycoplasma DNA PCR反響后電泳結(jié)果8.3 問(wèn)題分析8.3.1. Control Template是用于檢測(cè)PCR反響性能的。當(dāng)參加Control Template時(shí)，即使檢測(cè)樣品中含有Mycoplasma，也可能沒(méi)有擴(kuò)增獲得與Mycoplasma相對(duì)應(yīng)的片段，因此不要使用Control Template添加的反響進(jìn)行樣品的結(jié)果判定。為了獲得準(zhǔn)確的樣品檢測(cè)結(jié)果，在做PCR反響時(shí)，要保證檢測(cè)樣品是唯一的模板。8.3.2. 當(dāng)檢測(cè)樣品中含有大量Mycoplasma時(shí)，有時(shí)可能只有樣品中Mycoplasma的片段擴(kuò)增，而正對(duì)照的Control Template片段卻沒(méi)有擴(kuò)增。8.3.3. Control Template是人工合成的，序列中不含Mycoplasma的內(nèi)部序列。8.3.4