天然食品防腐劑——乳酸鏈球菌素

1、天然食品防腐劑乳酸鏈球菌素WWW.SFNCC.ORG.CN©2009-3-23國家食物與營養(yǎng)咨詢委員會(huì) 繆存影（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004）摘 要：本文介紹了乳酸鏈球菌素的理化性質(zhì)、抗菌機(jī)理、安全性及檢測方法的研究進(jìn)展，綜述了乳酸鏈球菌素在食品工業(yè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀。關(guān)鍵詞：食品防腐劑；乳酸鏈球菌素；抗菌機(jī)理；檢測方法；應(yīng)用防腐劑作為食品保鮮和貯藏的重要食品添加劑，其安全性日益受到食品加工行業(yè)的關(guān)注與重視。在食品加工中采用純天然的食品防腐劑、保鮮劑，生產(chǎn)出滿足消費(fèi)者需求的綠色食品，這將是防腐劑研究開發(fā)領(lǐng)域的重點(diǎn)。乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種乳酸菌代謝所產(chǎn)生的具有

2、很強(qiáng)殺菌作用的天然代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是一種高效、天然、綠色食品防腐劑。1 乳酸鏈球菌素的研究開發(fā)動(dòng)態(tài)早在1928年，美國學(xué)者Rogers和Whitter首先發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌的代謝產(chǎn)物能抑制乳酸桿菌的生長；1933年，Whitehead及其合作者觀察到，野生乳酸鏈球菌能抑制干酪制作中乳酸菌的生長和酸的產(chǎn)生，并發(fā)現(xiàn)抑制乳酸菌生長的乳酸鏈球菌代謝產(chǎn)物實(shí)質(zhì)上是一種多肽，并分離出這種物質(zhì)；1947年，Mattick和Hirsch研究發(fā)現(xiàn)血清學(xué)N群中的一些乳酸鏈球菌產(chǎn)生具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的抑制物，證明該物質(zhì)可抑制許多革蘭氏陽性菌，并將其命名為“NISIN”，取自“Ninhibitorv substance”。19

3、53年乳酸鏈球菌素的第一批商業(yè)產(chǎn)品Nisaplin在英國面市，Nisin作為商品進(jìn)入市場；1969年聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織（FAOWHO）食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)確認(rèn)Nisin可作為食品添加劑；1971年，Gross和Morell闡明了Nisin分子的完整結(jié)構(gòu)；1988年，Buchman等克隆了編碼Nisin前體的結(jié)構(gòu)基因并測定了DNA序列；1991年，Mulders等發(fā)現(xiàn)Nisin有2個(gè)天然變異體NisinA和NisinZ。我國于1990年開始批準(zhǔn)使用Nisin。到目前為止，全世界約有50多個(gè)國家和地區(qū)廣泛使用Nisin，英國已有40多年的應(yīng)用歷史，并實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。2 乳酸鏈球菌素

4、的性質(zhì)2.1 乳酸鏈球菌素的理化性質(zhì)乳酸鏈球菌素是一種高分子多肽，它的分子式為C143H228N42O37S7，由34個(gè)氨基酸組成，其氨基末端為異亮氨酸，羧基末端為賴氨酸，分子量為3510Da。一些研究表明，乳酸鏈菌素活性形式經(jīng)常出現(xiàn)二聚體和四聚體，相對分子量分別為7000Da和14000Da。Nisin在天然狀態(tài)下主要有兩種形式，分別為NisinA和NisinZ。Nisin的溶解性、穩(wěn)定性都與溶液的pH值密切相關(guān)。Nisin的溶解度隨pH值的下降而提高，pH值2.5時(shí)溶解度為12，pH值為5.0時(shí)下降到4，在中性及堿性條件下幾乎不溶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Nisin在酸性條件下極為穩(wěn)定，pH為2.

5、0條件下可耐受高溫處理（12l，15min），無活力損失，而在中性或堿性條件下即發(fā)生失活。2.2 乳酸鏈球菌素的抑菌特質(zhì)與機(jī)理乳酸鏈球菌素能有效地殺死或抑制引起食品腐敗變質(zhì)的革蘭氏陽性菌，特別是細(xì)菌孢子。如葡萄球菌、鏈球菌、乳桿菌、小球菌、明串珠菌、芽抱桿菌等均對乳酸鏈球菌素很敏感。通常細(xì)胞孢子耐熱性很強(qiáng)，一般殺菌條件難以將其殺滅，如鮮乳135，2s超高溫瞬時(shí)滅菌，芽孢死亡率為90，若同樣條件下再添加2.04.0IUml Nisin，則芽孢死亡率1001。而對革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌均無作用，但在一定條件下，如冷凍、加熱、降低pH值EDTA處理等，乳酸鏈球菌素亦可抑制一些革蘭陰性菌，如沙門氏菌

6、、大腸桿菌、假單胞菌等的生長。目前人們普遍認(rèn)為Nisin的抑菌機(jī)理類似于陽離子表面活性劑，其抑菌作用主要是殺菌，而非抑菌或溶菌，細(xì)胞膜是其作用位點(diǎn)，它抑制了細(xì)胞壁中肽聚糖的生物合成，從而使細(xì)胞壁質(zhì)膜與磷脂化合物合成受阻，并引起細(xì)胞內(nèi)含物和三磷酸腺苷等外泄，甚至導(dǎo)致細(xì)胞裂解。2.3 乳酸鏈球菌素的安全性英國Aplin公司從251份牛奶樣品中檢測到其中的109份樣品含有可產(chǎn)生Nisin的乳酸鏈球菌，說明Nisin天然存在于人們?nèi)粘ｏ嬘玫呐Ｄ讨?。乳酸鏈球菌素是多肽，食用后在消化道中很快被蛋白酶水解成氨基酸，不?huì)引起常用其他抗菌素出現(xiàn)的抗藥性，也不會(huì)改變?nèi)梭w腸道內(nèi)的正常菌群。病理學(xué)研究以及毒理學(xué)試驗(yàn)證

7、明，Nisin對人體安全無毒。3 乳酸鏈球菌素的檢測方法Nisin定量分析的最初測定的方法為1934年Cox GA等人建議采用的甲基藍(lán)還原法，后來相繼開發(fā)了用于Nisin定量的生物分析方法，包括試管稀釋法（TubeDilution）、濁度分析法（Turbidity Assays）、瓊脂擴(kuò)散法（Agar Diffusion Test）、ATP生物發(fā)光測定法（ATP Bioluminometry）、綠色熒光蛋白測定法（GFPbioassay）和微量滴定法（Microtitration）等。3.1 瓊脂擴(kuò)散法Nisin定量的生物分析法中最普遍是瓊脂擴(kuò)散法（ADT），尤其適用于那些高度不透明的、不能用

8、濁度分析法分析的樣品。Wolfand Gibbons（1996）改進(jìn)了瓊脂擴(kuò)散法，提高了靈敏度、準(zhǔn)確性。瓊脂擴(kuò)散法的原理是在瓊脂表面利用檢測菌的生長顯示抑菌效果，為消除干擾因素的影響，常使用Nisin標(biāo)準(zhǔn)液和未知樣液在同一平板擴(kuò)散，并由他們的抑菌圈直徑及標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)換算出效價(jià)。由于Nisin的擴(kuò)散性能差，故常在檢測培養(yǎng)基中加入1Tween以促進(jìn)Nisin在瓊脂中擴(kuò)散。目前測定常用的指示菌種為溶壁小球菌、金黃色葡萄球菌和滕黃微球菌，菌懸液的濃度約為107cfuml。3.2 免疫測定法生物分析的重要性不可否認(rèn)，但費(fèi)時(shí)，受低特效性、低靈敏度和源于食品提取液和發(fā)酵液相互干擾等因素的制約，借助于免疫方法的迅

9、速、直接和靈敏的技術(shù)，現(xiàn)已經(jīng)開發(fā)出定量檢測Nisin的免疫技術(shù)。Bouksaim報(bào)道了采用NisinZ多克隆抗體（pAb）的ELISA法，檢測出NisinZ的極限分別為：0.23nmolL（緩沖液）、0.5nmolL（牛奶）、1.49molL（復(fù)合培養(yǎng)基）；Falahee報(bào)道了采用羊多克隆抗體的夾心式（Sandwich）酶聯(lián)免疫吸附分析法測定NisinA的方法，獲得更高的靈敏度，最低檢測極限為0.15nmolL（純?nèi)芤海┖?9nmolL（奶酪）。Nandakumar將流動(dòng)注射系統(tǒng)（FIA）和ELISA進(jìn)行組合來測定Nisin，開發(fā)出一種采用單克隆抗體的連續(xù)的競爭流動(dòng)注射免疫分析系統(tǒng)（Compe

10、titive-Flow-Injection Immunoassay System），這個(gè)Flow-ELISA系統(tǒng)基于通過緩流載帶反應(yīng)物到固定在填充柱擔(dān)體中的抗體上，并通過一個(gè)膨脹床系統(tǒng)可以免去繁瑣耗時(shí)的凈化等前處理，可以用于直接測定懸浮液中的Nisin而不會(huì)有顯著干擾，從而實(shí)現(xiàn)了在線檢測發(fā)酵過程中的Nisin或者食品體系中的Nisin，該體系的響應(yīng)域值為690molL。4 乳酸鏈球菌素作為食品防腐劑的優(yōu)缺點(diǎn)乳酸鏈球菌素是一種多肽，人體食入后可被胃蛋白酶迅速分解為氨基酸，被人體吸收，不會(huì)改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群的存活，亦不會(huì)象抗生素一樣產(chǎn)生交叉抗性。乳酸鏈球菌素作為防腐劑添加于食品中，不會(huì)對食品的

11、色、香、味、口感產(chǎn)生副作用。乳酸鏈球菌素的使用可降低食品的殺菌溫度、減少熱處理時(shí)間，從而保持食品的良好風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值，并節(jié)省能源，提高工作效率。乳酸鏈球菌素的酸熱穩(wěn)定性和低溫貯藏穩(wěn)定性，有利于持久發(fā)揮其防腐效果，延長食品的保質(zhì)期和貨架期。乳酸鏈球菌素與熱處理殺菌相結(jié)合，可大大提高腐敗菌對熱的敏感性，尤其是芽抱。然而，作為食品防腐、保鮮劑的乳酸鏈球菌素存在著抗菌譜窄、只對G菌有作用，對G致病菌、酵母、霉菌及病毒無效等缺點(diǎn)。5 乳酸鏈球菌素在食品工業(yè)中的應(yīng)用乳酸鏈球菌素作為一種天然、無毒的防腐劑，在食品工業(yè)中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，如乳制品、肉制品、釀酒、果汁飲料、焙烤食品等。5.1 在乳制品中的應(yīng)用乳制

12、品營養(yǎng)豐富，極易腐敗變質(zhì)，經(jīng)巴氏滅菌和冷藏可延長保存期，但其中肉毒梭狀芽孢桿菌仍能存活，并產(chǎn)生一定毒素。Nisin可用于巴氏滅菌牛奶，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于全脂消毒牛乳、滅菌乳、風(fēng)味乳、淡煉乳、再制乳等各種乳制品的防腐和保鮮，添加3050IUml的乳酸鏈球菌素可使鮮奶的貨架期延長1倍。5.2 在肉制品中的應(yīng)用乳酸鏈球菌素可用于火腿、魚類等高蛋白食品，明顯改善其質(zhì)地、外觀，延長保存期，并可取代或降低亞硝酸鹽的用量。研究表明，75mgL乳酸鏈球菌素即可起到150mgL亞硝酸鹽的防腐效果。5.3 在罐頭制品中的應(yīng)用Nisin在酸性條件下易溶、穩(wěn)定，抑菌活力也高，因此可用于高酸性（pH4.6）罐頭的保鮮，可

13、以很好地保持內(nèi)容物的營養(yǎng)價(jià)值和良好感觀（色、香、味、形、質(zhì)地等）?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于西紅柿、馬鈴薯、蘑菇、水果等罐頭中。5.4 在醬菜中的應(yīng)用瓶裝醬菜是可供長期貯存的方便食品。目前，各類醬菜中含鹽量偏高，約在10%20之間，但高鹽食品易誘發(fā)高血壓等疾病。加入100mgkg Nisin，可抑制雜菌生長，并使鹽的濃度下降。由于一些國家在食品中不準(zhǔn)使用苯甲酸鈉，所以Nisin用于瓶裝醬菜出口，具有現(xiàn)實(shí)意義。5.5 在釀造工業(yè)中的應(yīng)用將乳酸鏈球菌素添加到發(fā)酵罐中防止和控制污染、延長非巴氏滅菌或生啤的貨架期，如啤酒發(fā)酵過程中即使加入1000IUml的乳酸鏈球菌素也不會(huì)影響啤酒酵母的生長和旺盛發(fā)酵，而雜菌卻得

14、到有效抑制。隨著人們生活水平的提高，健康食品、綠色食品的概念越來越被人們接受，對高效、無毒的天然防腐劑的研究和應(yīng)用也越來越引起人們的重視。Nisin作為一種高效、無毒的天然食品添加劑符合未來食品防腐劑的要求，不僅有較好的防腐抑菌作用，而且能減弱熱處理強(qiáng)度，降低加工成本，改善食品風(fēng)味、外觀和營養(yǎng)價(jià)值。參考文獻(xiàn)1張玉華，孟一.天然食品防腐劑 Nisin 的應(yīng)用.食品研究與開發(fā)，2003，24（2）：109-110.2陳秀珠，張振中，賈士芳.乳鏈菌肽的生物合成及其分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系.微生物學(xué)報(bào)，2002，42：628-633.3Gireesh T，et al.Biosynthesis of the

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