RNAi和siRNA轉(zhuǎn)染分享資料

1、1 1RNAi和siRNA轉(zhuǎn)染2 2內(nèi) 容第一部分第一部分 RNAi實驗基本概念實驗基本概念第二部分第二部分 RNAi實驗具體設(shè)計實驗具體設(shè)計第三部分第三部分 siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題及解答轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題及解答3 3第一部分RNAi實驗基本概念4 4主要內(nèi)容1.RNAi的概念的概念2.RNAi的啟動途徑的啟動途徑3.非哺乳動物系統(tǒng)的非哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗實驗4.哺乳動物系統(tǒng)的哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗實驗5.RNAi效應表現(xiàn)效應表現(xiàn)5 51.RNAi的概念RNA干擾干擾(RNA interference)是雙鏈是雙鏈RNA（dsRNA)特異性地結(jié)合到與之序列互補的特異性地結(jié)合到與之序

2、列互補的mRNA上，導致上，導致mRNA降解，從而介導的轉(zhuǎn)錄降解，從而介導的轉(zhuǎn)錄水平基因表達抑制。水平基因表達抑制。6 62006年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎共同授予安德年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎共同授予安德魯魯菲爾和克雷格菲爾和克雷格梅洛，他們發(fā)現(xiàn)了梅洛，他們發(fā)現(xiàn)了“RNA干擾機干擾機制制雙鏈雙鏈RNA沉默基因沉默基因”。7 72.RNAi的啟動途徑(1) dsRNA途徑途徑(2) siRNA途徑途徑(3) shRNA表達載體途徑表達載體途徑8 8(1) dsRNA途徑dsRNA:在非哺乳動物系統(tǒng)中，大于在非哺乳動物系統(tǒng)中，大于30bp的長的長雙鏈雙鏈RNA(dsRNA)進入細胞后，經(jīng)過胞質(zhì)內(nèi)雙進

3、入細胞后，經(jīng)過胞質(zhì)內(nèi)雙鏈特異性核酸酶鏈特異性核酸酶Dicer水解成水解成21-23bp的的siRNA，進一步導致進一步導致RNAi的發(fā)生。的發(fā)生。但在絕大多數(shù)哺乳動物系統(tǒng)中，超過但在絕大多數(shù)哺乳動物系統(tǒng)中，超過30bp的的dsRNA會引起細胞潛在的抗病毒機制（干擾素會引起細胞潛在的抗病毒機制（干擾素效應）降解效應）降解dsRNA。9 9(2) siRNA途徑小干擾小干擾RNA，長，長21-23bp，雙鏈。，雙鏈。作用機制：雙鏈的作用機制：雙鏈的siRNA解鏈并裝配入解鏈并裝配入RNA介介導的沉默復合物導的沉默復合物(RISC)，siRNA的反義鏈引導的反義鏈引導RISC與與mRNA分子互補結(jié)合

4、，并降解分子互補結(jié)合，并降解mRNA，最終導致特定基因表達的抑制。最終導致特定基因表達的抑制。1010(3) shRNA表達載體途徑shRNA（short hairpin RNA）表達載體在細）表達載體在細胞內(nèi)表達胞內(nèi)表達shRNA后，在后，在Dicer作用下形成作用下形成siRNA分子，導致分子，導致RNAi的發(fā)生。可能具有細胞毒性。的發(fā)生?？赡芫哂屑毎拘浴hRNAshRNA可能通可能通過競爭過競爭Exportin-5Exportin-5造造成致命毒性成致命毒性11113.非哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗如線蟲、果蠅等不涉及抗病毒免疫應答反應，如線蟲、果蠅等不涉及抗病毒免疫應答反應，可通過與

5、靶基因序列互補的長鏈可通過與靶基因序列互補的長鏈dsRNA（通常（通常200bp）介導）介導RNAi的發(fā)生的發(fā)生 。長鏈長鏈dsRNA通?？梢酝ㄟ^體外轉(zhuǎn)錄獲得。通?？梢酝ㄟ^體外轉(zhuǎn)錄獲得。長鏈長鏈dsRNA進入細胞后可被進入細胞后可被Dicer酶水解為多個酶水解為多個混合的混合的siRNA，敲除效果更好。，敲除效果更好。12124.哺乳動物系統(tǒng)的RNAi實驗通過轉(zhuǎn)染通過轉(zhuǎn)染siRNA：通常在：通常在3-7天可以維持較高的基天可以維持較高的基因表達抑制效應，效應期的長短主要取決于因表達抑制效應，效應期的長短主要取決于細胞細胞的增殖速度的增殖速度和和siRNA的有效性的有效性。大部分。大部分RNAi

6、實驗實驗可以在此時間段獲得結(jié)果，而且可以通過再次轉(zhuǎn)可以在此時間段獲得結(jié)果，而且可以通過再次轉(zhuǎn)染獲得超過染獲得超過1周的基因表達抑制時間。周的基因表達抑制時間。通過轉(zhuǎn)染通過轉(zhuǎn)染shRNA表達載體，可以獲得超過表達載體，可以獲得超過2周的周的基因表達抑制時間，在長效基因表達抑制時間，在長效RNAi實驗時，選擇實驗時，選擇shRNA表達載體較為合適。表達載體較為合適。13135.RNAi效應表現(xiàn)RNAi效應導致的靶基因下調(diào)可在效應導致的靶基因下調(diào)可在mRNA水平和水平和蛋白水平表現(xiàn)，也可能會在細胞形態(tài)等生理學蛋白水平表現(xiàn)，也可能會在細胞形態(tài)等生理學方面表現(xiàn)。方面表現(xiàn)。1414第二部分哺乳動物系統(tǒng)的R

7、NAi實驗設(shè)計1515主要內(nèi)容1. 需要短期抑制還是長效抑制需要短期抑制還是長效抑制?2. 采用采用siRNA進行實驗的途徑進行實驗的途徑3. 構(gòu)建構(gòu)建shRNA表達載體進行實驗表達載體進行實驗4. siRNA設(shè)計需要注意的問題設(shè)計需要注意的問題5. 脫靶效應脫靶效應6. 轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)染是RNAi實驗的瓶頸實驗的瓶頸16161.需要短期抑制還是長效抑制?1周以內(nèi)，采用周以內(nèi)，采用siRNA較好，無需構(gòu)建載體，節(jié)省較好，無需構(gòu)建載體，節(jié)省時間，還可以采用時間，還可以采用2次轉(zhuǎn)染的方法，延長次轉(zhuǎn)染的方法，延長RNAi作作用的時間到用的時間到2周。周。2周以上長效周以上長效RNAi實驗，采用實驗，采用s

8、hRNA表達載體較表達載體較好，效應持續(xù)時間長。好，效應持續(xù)時間長。17172. 采用siRNA進行實驗的途徑化學合成：首選的化學合成：首選的siRNA制備方法，最快、最制備方法，最快、最方便，成本高，適用于長期使用特定方便，成本高，適用于長期使用特定siRNA(2) 體外轉(zhuǎn)錄：費時，成本低，所需有效濃度低，體外轉(zhuǎn)錄：費時，成本低，所需有效濃度低，適用于大量篩選適用于大量篩選siRNASilencer siRNA Construction Kit（ThermoFisher）(3) Dicer/RNase酶解非哺乳動物系統(tǒng)的酶解非哺乳動物系統(tǒng)的RNAi三種方法均可做熒光標記，可及時得知轉(zhuǎn)染效率三

9、種方法均可做熒光標記，可及時得知轉(zhuǎn)染效率18183.構(gòu)建shRNA表達載體進行實驗需要構(gòu)建相關(guān)質(zhì)粒需要構(gòu)建相關(guān)質(zhì)?？衫幂d體上的抗生素等標記篩選，做長效表可利用載體上的抗生素等標記篩選，做長效表達達不能做熒光標記，無法直觀知道轉(zhuǎn)染效率不能做熒光標記，無法直觀知道轉(zhuǎn)染效率19194.siRNA設(shè)計需要注意的問題(1) siRNA序列設(shè)計序列設(shè)計(2) 陰性對照的作用陰性對照的作用(3) 陽性對照的重要性陽性對照的重要性(4) siRNA熒光標記的問題熒光標記的問題2020(1) siRNA的設(shè)計理想的理想的siRNA序列是特異性強，抑制效率高。序列是特異性強，抑制效率高?？赏ㄟ^檢索相關(guān)基因的文獻

10、報道序列，或者通過可通過檢索相關(guān)基因的文獻報道序列，或者通過在線設(shè)計軟件進行，一些技術(shù)力量較強的化學合在線設(shè)計軟件進行，一些技術(shù)力量較強的化學合成公司可提供免費設(shè)計。成公司可提供免費設(shè)計。如果有可能，多設(shè)計幾條如果有可能，多設(shè)計幾條siRNA 序列，以篩選最序列，以篩選最特異、最有效的特異、最有效的siRNA序列。序列。2121(2) 陰性對照siRNA的作用陰性對照陰性對照siRNA通常在進入細胞后不會引起任通常在進入細胞后不會引起任何基因表達的改變，從而反映出小分子何基因表達的改變，從而反映出小分子RNA片片段進入細胞后對基因表達的段進入細胞后對基因表達的非特異影響非特異影響。2222(3

11、) 陽性對照siRNA的重要性陽性對照陽性對照siRNA采用確認有效的采用確認有效的siRNA，針對，針對某些較容易檢測基因，如甘油醛某些較容易檢測基因，如甘油醛3-磷酸脫氫磷酸脫氫酶（酶（GAPDH）基因；）基因；用于確認用于確認RNAi實驗過程的有效性實驗過程的有效性，包括轉(zhuǎn)染條，包括轉(zhuǎn)染條件、檢測方法是否可行等；件、檢測方法是否可行等；陽性對照陽性對照siRNA在在RNAi實驗初期或在新的轉(zhuǎn)染實驗初期或在新的轉(zhuǎn)染體系進行體系進行RNAi實驗時很重要，容易被忽視，缺實驗時很重要，容易被忽視，缺乏陽性對照乏陽性對照siRNA，實驗出問題無法找原因，實驗出問題無法找原因，耽誤時間。耽誤時間。2

12、323(4) siRNA熒光標記的問題采用熒光標記的采用熒光標記的siRNA可以用來確定轉(zhuǎn)染效率可以用來確定轉(zhuǎn)染效率和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，這種方法操作快速，實驗費和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，這種方法操作快速，實驗費用也不高，但由于熒光標記的用也不高，但由于熒光標記的siRNA攝入與攝入與siRNA導致的抑制效果時常會出現(xiàn)不相關(guān)性，導致的抑制效果時常會出現(xiàn)不相關(guān)性，這種情況在某些細胞系和應用某些轉(zhuǎn)染試劑時，這種情況在某些細胞系和應用某些轉(zhuǎn)染試劑時，如脂質(zhì)體時更為嚴重。因此在應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染如脂質(zhì)體時更為嚴重。因此在應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時，不推薦使用熒光標記的試劑優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時，不推薦使用熒光標記的siRN

13、A。24245.RNAi Off-target(脫靶效應)(1) 什么是什么是RNAi Off-target(脫靶效應脫靶效應)?(2) 脫靶效應如何檢測？脫靶效應如何檢測？(3) siRNA濃度是否和脫靶效應相關(guān)？濃度是否和脫靶效應相關(guān)？(4) 轉(zhuǎn)染試劑是否也會造成脫靶效應？轉(zhuǎn)染試劑是否也會造成脫靶效應？(5) 如何避免脫靶效應？如何避免脫靶效應？2525(1) RNAi Off-target(脫靶效應)是什么？RNAi Off-target(脫靶效應脫靶效應)：簡單地說，就是：簡單地說，就是siRNA轉(zhuǎn)染中的非特異反應轉(zhuǎn)染中的非特異反應，這不僅包括，這不僅包括siRNA序列，還包括轉(zhuǎn)染試劑

14、本身或其他相關(guān)序列，還包括轉(zhuǎn)染試劑本身或其他相關(guān)因素對轉(zhuǎn)染細胞的其他相關(guān)基因發(fā)生非特異性因素對轉(zhuǎn)染細胞的其他相關(guān)基因發(fā)生非特異性的表達變化，從而導致假陽性和假陰性。目前的表達變化，從而導致假陽性和假陰性。目前已廣泛引起研究者重視。已廣泛引起研究者重視。2626(2) 脫靶效應如何檢測？多種方法可以用于預測和檢測脫靶效應，最常多種方法可以用于預測和檢測脫靶效應，最常見的方法是基因表達譜芯片的方法。見的方法是基因表達譜芯片的方法。2727(3) siRNA濃度是否和脫靶效應相關(guān)？以前認為高濃度會產(chǎn)生脫靶效應，實際上低濃以前認為高濃度會產(chǎn)生脫靶效應，實際上低濃度同樣會產(chǎn)生脫靶效應。度同樣會產(chǎn)生脫靶效

15、應。2828(4) 轉(zhuǎn)染試劑是否也會造成脫靶效應？有人采用基因芯片檢測對轉(zhuǎn)染試劑造成的細胞有人采用基因芯片檢測對轉(zhuǎn)染試劑造成的細胞基因表達影響發(fā)現(xiàn)，某脂質(zhì)體基因表達影響發(fā)現(xiàn)，某脂質(zhì)體L2K可以引發(fā)可以引發(fā)1908個基因的表達變化，既包括下調(diào)，也包括個基因的表達變化，既包括下調(diào)，也包括上調(diào)。上調(diào)。如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會導致某基因表如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會導致某基因表達上調(diào)，可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)染達上調(diào)，可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后該基因可能會后該基因可能會出現(xiàn)表達不變甚至增強的現(xiàn)象出現(xiàn)表達不變甚至增強的現(xiàn)象，從而出現(xiàn)假陰，從而出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會導致某基因性現(xiàn)象，如果恰好轉(zhuǎn)染試劑本身會導致某基

16、因表達下調(diào)，則會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。表達下調(diào)，則會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。2929(5) 如何避免脫靶效應？脫靶效應并不能絕對避免，但可以采取措施減脫靶效應并不能絕對避免，但可以采取措施減少脫靶效應的發(fā)生，如針對同一靶基因設(shè)計少脫靶效應的發(fā)生，如針對同一靶基因設(shè)計2條條以上抑制效率在以上抑制效率在70以上的以上的不同不同siRNA序列，序列，分別進行實驗分別進行實驗，可避免，可避免siRNA造成的脫靶效應；造成的脫靶效應；采用采用不同轉(zhuǎn)染試劑不同轉(zhuǎn)染試劑進行實驗可避免轉(zhuǎn)染試劑造進行實驗可避免轉(zhuǎn)染試劑造成的脫靶效應等。成的脫靶效應等。30306.轉(zhuǎn)染是RNAi實驗的瓶頸轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)染是siRNA實驗的瓶頸，轉(zhuǎn)染

17、質(zhì)量的好壞直實驗的瓶頸，轉(zhuǎn)染質(zhì)量的好壞直接關(guān)系接關(guān)系RNAi實驗的成敗。實驗的成敗。(1) 選擇轉(zhuǎn)染方法的原則選擇轉(zhuǎn)染方法的原則(2) siRNA轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染的方法(3) siRNA轉(zhuǎn)染試劑的主要種類轉(zhuǎn)染試劑的主要種類(4) 脂質(zhì)體脂質(zhì)體(5) 非脂質(zhì)體聚合物類非脂質(zhì)體聚合物類3131(1) 選擇轉(zhuǎn)染方法的原則高轉(zhuǎn)染效率高轉(zhuǎn)染效率：較高的轉(zhuǎn)染效率可以取得更好的抑制效果，：較高的轉(zhuǎn)染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于實驗結(jié)果的觀察；更有利于實驗結(jié)果的觀察；低細胞毒性低細胞毒性：因為：因為RNAi是抑制性實驗，轉(zhuǎn)染試劑的毒性是抑制性實驗，轉(zhuǎn)染試劑的毒性多導致細胞凋亡等結(jié)果，這種結(jié)果是對細胞正常

18、生理功能多導致細胞凋亡等結(jié)果，這種結(jié)果是對細胞正常生理功能嚴重干擾（主要表現(xiàn)為抑制），細胞無法進行正常轉(zhuǎn)錄表嚴重干擾（主要表現(xiàn)為抑制），細胞無法進行正常轉(zhuǎn)錄表達而出現(xiàn)凋亡。轉(zhuǎn)染試劑的毒性不僅干擾細胞正常的生理達而出現(xiàn)凋亡。轉(zhuǎn)染試劑的毒性不僅干擾細胞正常的生理狀態(tài)，甚至還可能影響實驗結(jié)果；狀態(tài)，甚至還可能影響實驗結(jié)果；方法簡單、操作簡單方法簡單、操作簡單：越簡單，操作越少的實驗過程，自：越簡單，操作越少的實驗過程，自然出錯的機會就少，重復性就好，工作量也少；然出錯的機會就少，重復性就好，工作量也少；成本較低成本較低：由于：由于siRNA轉(zhuǎn)染需要篩選有效的轉(zhuǎn)染需要篩選有效的siRNA，有效，有效s

19、iRNA后續(xù)大量研究還需要不斷進行后續(xù)大量研究還需要不斷進行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染，siRNA轉(zhuǎn)染的成本尤其是轉(zhuǎn)染試劑的成本在實驗開始之初就需要轉(zhuǎn)染的成本尤其是轉(zhuǎn)染試劑的成本在實驗開始之初就需要充分考慮。充分考慮。3232(2) siRNA轉(zhuǎn)染的方法到目前為止，轉(zhuǎn)染的方法主要采用化學方法，到目前為止，轉(zhuǎn)染的方法主要采用化學方法，化學方法不能轉(zhuǎn)染的采用電轉(zhuǎn)化等物理方法?；瘜W方法不能轉(zhuǎn)染的采用電轉(zhuǎn)化等物理方法。3333(3) siRNA轉(zhuǎn)染試劑的主要種類脂質(zhì)體類脂質(zhì)體類非脂質(zhì)體聚合物類非脂質(zhì)體聚合物類3434(4) 脂質(zhì)體開發(fā)較早，主要針對轉(zhuǎn)染質(zhì)粒開發(fā)較早，主要針對轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA等大分子開發(fā)，等大分

20、子開發(fā)，現(xiàn)在也被改良用于現(xiàn)在也被改良用于siRNA的轉(zhuǎn)染；的轉(zhuǎn)染；適合適合siRNA與質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)以及一些對毒性要求不與質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)以及一些對毒性要求不高的高的siRNA轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染；代表產(chǎn)品有代表產(chǎn)品有invitrogen公司的公司的lipofectamineTM 2000/3000和和RNAiMAX。3535(5) 非脂質(zhì)體聚合物類為克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的毒性，并提高轉(zhuǎn)染效率，現(xiàn)在已從為克服脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的毒性，并提高轉(zhuǎn)染效率，現(xiàn)在已從高分子聚合物類轉(zhuǎn)染試劑發(fā)展到納米聚合物類轉(zhuǎn)染試劑。高分子聚合物類轉(zhuǎn)染試劑發(fā)展到納米聚合物類轉(zhuǎn)染試劑。代表產(chǎn)品有：代表產(chǎn)品有：Merck公司的公司的NanoJuice

21、 Transfection Kit（Caco-2）；）；Qiagen公司的公司的HiperFect；Clontech公司的公司的XfectTM；Micropoly公司的公司的Micropoly-transfecterTM cell reagent；Engreen Biosystem公司的公司的EntransterTM-R等。等。3636第三部分siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題及解答1.siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題2.siRNA轉(zhuǎn)染疑問解答轉(zhuǎn)染疑問解答37371.siRNA轉(zhuǎn)染過程相關(guān)問題(1) 轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量的問題轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量的問題(2) 轉(zhuǎn)染時轉(zhuǎn)染時siRNA工作濃度工作濃度(3) 轉(zhuǎn)

22、染時血清的問題轉(zhuǎn)染時血清的問題(4) 轉(zhuǎn)染時抗生素的問題轉(zhuǎn)染時抗生素的問題(5) 轉(zhuǎn)染過程轉(zhuǎn)染過程(6) 轉(zhuǎn)染后換液的問題轉(zhuǎn)染后換液的問題(7) 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問題轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的問題(8) RNAi效應檢測方法效應檢測方法3838(1) 轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量的問題細胞數(shù)量：以轉(zhuǎn)染時，細胞的匯合度在細胞數(shù)量：以轉(zhuǎn)染時，細胞的匯合度在20-40為宜，這個匯合度比通常為宜，這個匯合度比通常DNA轉(zhuǎn)染的匯合度要小，轉(zhuǎn)染的匯合度要小，這是因為轉(zhuǎn)染后需要培養(yǎng)的時間通常比這是因為轉(zhuǎn)染后需要培養(yǎng)的時間通常比DNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染的時間要長，同時較低的細胞數(shù)量也有利于提高的時間要長，同時較低的細胞數(shù)量也有利于提高抑制效率。抑制

23、效率。需要注意的是：轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度（細胞數(shù)量）需要注意的是：轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度（細胞數(shù)量）會對會對RNAi結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。一些轉(zhuǎn)染試劑，結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要的匯合度會高一些，這是為了減如脂質(zhì)體，需要的匯合度會高一些，這是為了減輕轉(zhuǎn)染試劑的毒性，一般來說，輕轉(zhuǎn)染試劑的毒性，一般來說，細胞數(shù)量較少更細胞數(shù)量較少更能提高抑制效率能提高抑制效率。3939(2) 轉(zhuǎn)染時siRNA工作濃度siRNA濃度：需要根據(jù)具體的實驗進行相關(guān)的優(yōu)化。過低濃度：需要根據(jù)具體的實驗進行相關(guān)的優(yōu)化。過低的的siRNA濃度達不到相應的抑制效果，過高的濃度達不到相應的抑制效果，過高的siRN

24、A濃度濃度可能會引起一些非特異的改變。需要注意的是這里可能會引起一些非特異的改變。需要注意的是這里siRNA濃度指濃度指siRNA在反應時的終濃度，也就是以轉(zhuǎn)染時細胞的在反應時的終濃度，也就是以轉(zhuǎn)染時細胞的總體積來計算的?？傮w積來計算的。一般一般siRNA的有效反應濃度在的有效反應濃度在10nM-200nM，選擇最低有效濃度，選擇最低有效濃度。需要注意的是：需要注意的是：siRNA的分子量，對的分子量，對21nt雙鏈雙鏈siRNA oligo來說，平均分子量約為來說，平均分子量約為13300g/mol，合成，合成siRNA其其OD值和值和nmol換算關(guān)系由于換算關(guān)系由于OD值受產(chǎn)物中其他成分影

25、響，值受產(chǎn)物中其他成分影響，如熒光標記、純度等，具體請詢問合成公司，一般如熒光標記、純度等，具體請詢問合成公司，一般1OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。 4040(3) 轉(zhuǎn)染時血清的問題一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后染后4-6h再更換成有血清培養(yǎng)基，這其實是為了再更換成有血清培養(yǎng)基，這其實是為了減輕轉(zhuǎn)染造成的細胞毒性。現(xiàn)在較好的轉(zhuǎn)染試劑減輕轉(zhuǎn)染造成的細胞毒性?，F(xiàn)在較好的轉(zhuǎn)染試劑也能在血清存在下轉(zhuǎn)染。也能在血清存在下轉(zhuǎn)染。4141(4) 轉(zhuǎn)染時抗生素的問題一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂質(zhì)體，需要在轉(zhuǎn)染時采用無一些轉(zhuǎn)染試劑，如脂

26、質(zhì)體，需要在轉(zhuǎn)染時采用無抗生素培養(yǎng)基，這是由于抗生素培養(yǎng)基，這是由于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染會同時將培脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染會同時將培養(yǎng)基的一些成份包括抗生素也帶進細胞，造成細養(yǎng)基的一些成份包括抗生素也帶進細胞，造成細胞毒性胞毒性?，F(xiàn)在較好的轉(zhuǎn)染試劑也不要求去除抗生?，F(xiàn)在較好的轉(zhuǎn)染試劑也不要求去除抗生素。素。4242(5) 轉(zhuǎn)染過程轉(zhuǎn)染過程：轉(zhuǎn)染的過程其實很簡單。一般是分轉(zhuǎn)染過程：轉(zhuǎn)染的過程其實很簡單。一般是分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑和別稀釋轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，然后二者混合，滴，然后二者混合，滴加到細胞表面，然后細胞繼續(xù)培養(yǎng)。這點根據(jù)加到細胞表面，然后細胞繼續(xù)培養(yǎng)。這點根據(jù)不同轉(zhuǎn)染試劑的不同轉(zhuǎn)染試劑的Protocol操作即可。操作即可。4343(6) 轉(zhuǎn)染后換液的問題一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染后一些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染后4-6h換液，其目的就換液，其目的就是去除在培