SDS-PAGE電泳實驗步驟

1、垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離卵白質(zhì)之勘阻及廣創(chuàng)作創(chuàng)作時間：二零二一年六月三十日一、實驗目的學習SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE測定卵白質(zhì)的分子量的原理和基本把持技術(shù)二、實驗原理卵白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下解離而帶電荷.當溶液的pH年夜于卵白質(zhì)的等電點(pI)時，卵白質(zhì)白己帶負電在電場中將向正極移動；當溶液的pH小于卵白質(zhì)的等電點時，卵白質(zhì)帶正電，在電場中將向負極移動；卵白質(zhì)在特定電場中移動的速度取決于其白己所帶的凈電荷的幾多、卵白質(zhì)顆粒的年夜小和分子形狀、電場強度等.聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu).本實一6.8,下層膠pH=8.9

2、;Tris一HCI緩沖液中的Tris用于維持溶液的電中性及pH,是緩沖配對離子；CI-是前導離子.在pH6.8時，緩沖液中的Gly-為尾隨離子，而在pH=8.9時,Gly的解離度增加；這樣濃縮膠和分離膠之間pH的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度，進而達到控制其有效遷移率之目的.分歧卵白質(zhì)具有分歧的等電點，在進入分離膠后，各種卵白質(zhì)由于所帶的靜電荷分歧，而有分歧的遷移率.由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應，分子篩效應及電荷效應，使分歧的卵白質(zhì)在同一電場中達到有效的分離如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS),由于SDS帶有年夜量的負電荷，且這種陰離子概況活性劑能使卵白質(zhì)變

3、性，特別是在強還原劑如筑基乙醇存在下，卵白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使卵白質(zhì)分子與SDS充沛結(jié)合，形成帶負電性的卵白質(zhì)一SDS復合物；此時，卵白質(zhì)分子上所帶的負電荷量遠遠超越卵白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了分歧卵白質(zhì)間所帶電荷上的不同.卵白質(zhì)分子量愈小，在電場中移動得愈快；反之，愈慢.卵白質(zhì)的分子量與電泳遷移率之間的關(guān)系是：M=K(10-bDlogMr=LogKb-Rm,式中Mr卵白質(zhì)的分子量；logK截距；b斜率；Rm相對遷移率.實驗證明，卵白質(zhì)分子量在15,000200,000的范圍內(nèi)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)之間呈線性關(guān)系.卵白質(zhì)的相對遷移率品=卵白質(zhì)樣品的遷移距離/染料(漠酚

4、藍)遷移距離.這樣，在同一電場中進行電泳，把標準卵白質(zhì)的相對遷移率與相應的卵白質(zhì)分子量對數(shù)作圖，由未知卵白的相對遷移率可從標準曲線上求出它的分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定卵白質(zhì)的分子量具有簡便、快速、重復性好的優(yōu)點，是目前一般實驗室經(jīng)常使用的測定卵白質(zhì)分子量的方法.1) 三、試劑及主要器材1.主要試劑標準卵白混合液內(nèi)含：兔磷酸化酶B(Mw97,400),牛血清卵白(Mw66,200),兔肌動卵白(Mw43,000),牛磷酸酊酶(Mw31,000)和雞蛋清溶菌酶(Mw14,400)30%凝膠貯備液：丙烯酰胺(Acr)29.2g,亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)0.8g,加雙

5、蒸水至100mL.外包錫紙，4C冰箱保管，30天內(nèi)使用.2) 分離膠緩沖液(1.5mol/L):Tris18.17g,加雙蒸水溶3) 解,6mol/LHCl調(diào)pH8.8,定容100mL.4C冰箱保管濃縮膠緩沖液(0.5mol/L):Tris6.06g,加水溶解，6mol/LHCl調(diào)pH6.8,并定容到100mL.4C冰箱保管電極緩沖液(pH8.3):SDSlg,Tris3g,Gly14.4g,加雙蒸水溶解并定容到1000mL.4C冰箱保管.4) 10%SDS,室溫保管質(zhì)量濃度10%過硫酸鉉(新鮮配制)上樣緩沖液：0.5mol/LTris-HClpH6.81.25mL,甘油2mL,10%SDS2

6、mL,6-筑基乙醇1mL,0.1%漠酚藍0.5mL,加蒸館水定溶至10mL.0.25%考馬斯亮藍R-250染色液：0.25g考馬斯亮藍R250,加入91ml50%甲醇,9ml冰醋酸脫色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸與875ml雙蒸水混合未知分子量的卵白質(zhì)樣品(1mg/mL)實驗器材DYCZ-24D垂直板電泳槽(北京市六一儀器廠)電泳儀長滴管及微量加樣器燒杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、250m1)、培養(yǎng)皿(15cml5cm)注射器等四、實驗把持1,裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后拔

7、出斜插板到適中水平，即可灌膠.凝膠的聚合分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置10%的分離膠和4.8%的濃縮膠.試劑名稱10%勺分離膠5%勺濃縮膠Acr/Bis30%/ml分離膠緩沖液（pH8.9）/ml濃縮膠緩沖液（pH6.8）10%SDS/ml10%過硫酸俊/ul雙蒸水/mlTEMED/ul05050255按上表各液加入混勻后配制成份離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩用滴管滴入，小心不要發(fā)生氣泡.將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止，約5mL.然后用細滴管或注射器仔細注入少量水，約0.5-1mL.室溫放置聚合30-40min.待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠概

8、況的水分，按上表制備濃縮膠.用長滴管小心加到分離膠的上面，拔出樣品模子（梳子）；待濃縮膠聚合后，小心拔出樣品模子.2. 卵白質(zhì)樣品的處置若標準卵白質(zhì)或欲分離的卵白質(zhì)樣品是固體，稱取lmg的樣品溶解于lmL0.5mol/LpH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸館水中；若樣品是液體，要測定卵白質(zhì)濃度，按1.01.5mg/mL溶液比例，取卵白質(zhì)樣液與樣品處置液等體積混勻.本實驗所用樣品為1520g的標準卵白樣品溶液，放置在0.5mL的離心管中，加入1520l的樣品處置液.在100C水浴中處置2min,冷卻至室溫后備用.吸取未知分子量的卵白質(zhì)樣品20l,依照標準卵白的處置方法進行處置.加樣SDS-聚丙烯酰

9、胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法用手夾住兩塊玻璃板，上提斜插板使其松開,然后取下玻璃膠室去失落密封用硅膠框，注意在上述過程中手始終給玻璃膠室一個夾緊力，再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽，拔出斜板，將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上，外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可，注意防止在電泳槽內(nèi)呈現(xiàn)氣泡.加樣時可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準確定位加樣位置，或用微量注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣，各加10151（含卵白質(zhì)1015g）,稀溶液可加2030l（還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握）.3. 電泳加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，翻開電泳儀開關(guān)后，樣品進膠前電流控制在1520mA,年夜約1520min;樣品中的漠

10、酚藍指示劑達到分離膠之后，電流升到3045mA,電泳過程堅持電流穩(wěn)定.當漠酚藍指示劑遷移到距前沿12cm處即停止電泳，約1-2小時.如室溫高，翻開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度.4. 染色、脫色電泳結(jié)束后，關(guān)失落電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開,然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心拔出銅絲作為標識表記標幟，放入年夜培養(yǎng)皿中染色，使用0.25%的考馬斯亮藍染液，染色24h,需要時可過夜.棄去染色液，用蒸館水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進行擴散脫色，經(jīng)常換脫色液，直至卵白質(zhì)帶清晰為止.結(jié)果處置1）丈量脫色后凝膠板的長度和每個卵白質(zhì)樣品移動距離（即卵

11、白質(zhì)帶中心到加樣孔的距離）,丈量指示染料遷移的距離.2）按以下公式計算卵白質(zhì)樣品的相對遷移率（Rm）相對遷移率=樣品遷移距離（cm）/染料遷移距離（cm）3）標準曲線的制作：以各標準卵白質(zhì)相對遷移率為橫坐標，卵白質(zhì)分子量的對數(shù)為縱坐標在半對數(shù)坐標紙上做圖，獲得一條標準曲線.4）測定卵白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測卵白質(zhì)樣品的相對遷移1. 率，從標準曲線上查得該卵白質(zhì)的分子量五、思考題聚丙烯酰胺盤狀凝膠電泳的幾個不連續(xù)性是什么？2. 電泳時的三個物理效應是什么？是怎樣造成的？3. 電泳后上下槽緩沖液可否混合后再使用？為什么？4. 上樣緩沖液中加入甘油的作用是什么？5. 貯液配制及貯存應注意什么？6. 過硫酸鉉、