美國(guó)病理學(xué)會(huì)對(duì)于二代測(cè)序臨床診斷的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上美國(guó)病理學(xué)會(huì)（CAP）對(duì)于二代測(cè)序臨床診斷的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)于桑格測(cè)序來(lái)說(shuō)，二代測(cè)序的較高的通量和每個(gè)堿基所消耗較低的成本，使得其快速應(yīng)用于臨床檢測(cè)領(lǐng)域。盡管在1988年美國(guó)病理學(xué)會(huì)（CAP）沒(méi)有給出這項(xiàng)技術(shù)在臨床診斷上的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。但在過(guò)去的幾年，能夠提供二代測(cè)序檢測(cè)服務(wù)的實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)的不斷增加。目的：針對(duì)應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)的臨床診斷給出一個(gè)檢查清單用以標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)和生物信息數(shù)據(jù)分析平臺(tái)。因?yàn)榛贜GS的臨床檢測(cè)是一個(gè)新的診斷技術(shù)，而且相對(duì)于一代測(cè)序其更為復(fù)雜，所以目前亟需針對(duì)這些檢測(cè)制定新的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。設(shè)計(jì)：針對(duì)NGS制定必要的規(guī)章制度，促進(jìn)這項(xiàng)技術(shù)更好地應(yīng)用于

2、臨床檢測(cè)。在2011年CAP成立了NGS工作組委員會(huì)，以對(duì)檢測(cè)清單的項(xiàng)目?jī)?nèi)容進(jìn)行仔細(xì)研究。結(jié)果：在CAP分子病理學(xué)檢測(cè)清單中總共包含針對(duì)實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)和生物信息數(shù)據(jù)分析平臺(tái)的18項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證要求清單。結(jié)論：這項(xiàng)經(jīng)CAP委員會(huì)認(rèn)真考慮后所給的報(bào)告陳述了對(duì)于制定新的檢測(cè)清單的重要性。其中包含文件、批準(zhǔn)、質(zhì)保、驗(yàn)證、異常日志、監(jiān)控升級(jí)、各個(gè)版本解釋及報(bào)告、附帶的發(fā)現(xiàn)、數(shù)據(jù)儲(chǔ)藏、可追溯性模板、數(shù)據(jù)傳送保密性等的處理。DNA測(cè)序即二代測(cè)序技術(shù)（NGS）由七十年代的化學(xué)測(cè)序法和桑格測(cè)序法逐漸演化而來(lái)。NGS與一代測(cè)序主要的不同是其可以并行的對(duì)數(shù)以百萬(wàn)的DNA短片段同時(shí)測(cè)序而非僅有一種DNA片段。在九十年代中

3、期基于熒光毛細(xì)管凝膠電泳的自動(dòng)化桑格測(cè)序的產(chǎn)生使得DNA測(cè)序普遍應(yīng)用于臨床診斷。而NGS更高的通量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)自動(dòng)化桑格測(cè)序。二代測(cè)序的較高的通量和每個(gè)堿基所消耗較低的成本，使得其快速應(yīng)用于臨床檢測(cè)領(lǐng)域，盡管NGS各方面分析都更為復(fù)雜。包括數(shù)據(jù)獲得和儲(chǔ)藏的案例遠(yuǎn)超出于1988年臨床檢驗(yàn)科改善后的實(shí)驗(yàn)室修正案，對(duì)于后續(xù)數(shù)據(jù)計(jì)算具有較大挑戰(zhàn)性。NGS檢測(cè)的領(lǐng)域涉及遺傳病、實(shí)體瘤、惡性血液病、傳染性疾病，人類(lèi)白細(xì)胞抗原分析，非侵害性產(chǎn)前診斷，胎兒染色體異常檢測(cè)。但在過(guò)去的幾年，能夠提供二代測(cè)序檢測(cè)服務(wù)的實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)的不斷增加。盡管在1988年美國(guó)病理學(xué)會(huì)（CAP）沒(méi)有給出這項(xiàng)技術(shù)在臨床診斷上的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)規(guī)

4、范。為應(yīng)對(duì)這種需求，CAP成立了NGS工作組委員會(huì)，以在這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展初期制定第一套臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。考慮到基于NGS的測(cè)序技術(shù)是在原有技術(shù)上對(duì)儀器、測(cè)序反應(yīng)試劑、生物信息分析等的改進(jìn)，工作組致力于制定一套用于規(guī)范NGS臨床檢測(cè)的工作框架管理標(biāo)準(zhǔn)以更好地采納基于NGS的檢測(cè)技術(shù)。二代測(cè)序技術(shù)由兩部分組成，實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)和生物信息分析平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)一般包含所有的以下流程：病人樣品采集處理，核酸提取，片段化，分子標(biāo)簽，外顯子組或基因組靶序列富集，接頭連接，擴(kuò)增，文庫(kù)準(zhǔn)備，上樣，序列讀出。序列是通過(guò)對(duì)數(shù)以百萬(wàn)的DNA片段的讀取全自動(dòng)化的產(chǎn)生?；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)后便是大規(guī)模的計(jì)算和生物信息分析。通過(guò)各種的算法將

5、測(cè)到的短的序列去比對(duì)匹配人類(lèi)參考基因組序列。經(jīng)過(guò)圖譜比對(duì)后，與參考基因組不同的核苷酸變異被識(shí)別出來(lái)。另一個(gè)獨(dú)立進(jìn)程是去逐一的或組合的根據(jù)其相應(yīng)的臨床表現(xiàn)去分析與臨床相關(guān)的變異類(lèi)型。對(duì)于個(gè)別病人案例，已經(jīng)被確認(rèn)的變異參考其正常基因功能受損的注釋內(nèi)容進(jìn)行評(píng)估，如早產(chǎn)轉(zhuǎn)錄因子、截?cái)嗟鞍?、非同義突變對(duì)蛋白功能的影響或剪接位點(diǎn)的改變。為了對(duì)疾病和有害突變的關(guān)系做出明智的決定，需要根據(jù)病人的臨床癥狀結(jié)合基因組研究成果。作圖比對(duì)、變異識(shí)別、變異注釋以及一定程度上的臨床解釋包含了生物信息分析的全部工作框架。CAP NGS工作組考慮到化學(xué)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)平臺(tái)與生物信息分析平臺(tái)是相分離的，所以制定的標(biāo)準(zhǔn)也是分開(kāi)的。一部分

6、實(shí)驗(yàn)室利用國(guó)外的設(shè)備去進(jìn)行一部分的二代測(cè)序檢測(cè)。一個(gè)實(shí)驗(yàn)室提供從實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)到生物信息分析，他們臨床檢測(cè)的驗(yàn)證可以整合起來(lái)。在CAP分子病理學(xué)檢測(cè)清單中總共包含針對(duì)實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)和生物信息數(shù)據(jù)分析平臺(tái)的18項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證要求清單。NGS檢測(cè)項(xiàng)目清單包括對(duì)于流程文件建立、批準(zhǔn)、質(zhì)保、驗(yàn)證、異常日志、監(jiān)控升級(jí)、各個(gè)版本解釋及報(bào)告、附帶的發(fā)現(xiàn)、數(shù)據(jù)儲(chǔ)藏、版本可追溯性、數(shù)據(jù)傳送保密性等的處理。如同這份報(bào)告中描述一樣，工作組的目標(biāo)就是為NGS檢測(cè)服務(wù)提供最初的基本鑒定合格需求?？梢灶A(yù)見(jiàn)的就是只要基礎(chǔ)的檢測(cè)驗(yàn)證規(guī)范需求到位后，隨后便會(huì)有附加的其它專(zhuān)門(mén)規(guī)程。這些在注釋部分對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步解決。這項(xiàng)經(jīng)CAP委員會(huì)認(rèn)

7、真考慮后所給的報(bào)告陳述了對(duì)于制定新的檢測(cè)清單的重要性。另外，這份報(bào)告可以作為CAP NGS檢測(cè)清單的補(bǔ)充，因此內(nèi)容上與2014年檢測(cè)清單需求緊密相連。NGS實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件實(shí)驗(yàn)室需要建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件。一個(gè)詳實(shí)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件是臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要部分。所有的DNA/RNA樣品準(zhǔn)備、片段化、文庫(kù)準(zhǔn)備、分子標(biāo)簽、樣品混合、合成測(cè)序相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作必須建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件，這樣才能對(duì)每一步及隨后的操作進(jìn)行追蹤。這包含所有的方法、試劑、儀器、儀器軟件、之前的版本等。另外，對(duì)于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)也需要進(jìn)行描述。一些案例在后面重點(diǎn)提出。NGS靶序列實(shí)驗(yàn)（例如多基因模塊或外顯子測(cè)序）可以在測(cè)序前對(duì)感興趣

8、的基因區(qū)域進(jìn)行捕獲，關(guān)于捕獲區(qū)域的詳細(xì)信息以及富集步驟都應(yīng)以文件的形式進(jìn)行詳細(xì)描述。對(duì)于處理不同類(lèi)型樣品的臨床實(shí)驗(yàn)室，如血液、石蠟包埋的福爾馬林固定的樣本，都應(yīng)該針對(duì)不同樣品制定相應(yīng)的SOPs。用于將病人樣本合并的反應(yīng)試劑和規(guī)程必須詳細(xì)說(shuō)明，并且其中應(yīng)包含測(cè)序接頭信息。用于對(duì)運(yùn)行好壞的評(píng)價(jià)的質(zhì)控參數(shù)的權(quán)衡也需要文件化。常用的度量如目標(biāo)區(qū)域內(nèi)Reads數(shù)的比例，質(zhì)量符合規(guī)定的堿基比例，覆蓋度的閾值，平均測(cè)序深度。實(shí)驗(yàn)室必須明文規(guī)定好樣品制備和測(cè)序的接收或拒收標(biāo)準(zhǔn)。最重要的是明確和總結(jié)不能夠進(jìn)行分析的區(qū)域（如測(cè)序深度不充分）。NGS實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室對(duì)NGS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)進(jìn)行驗(yàn)證，當(dāng)有所修改變動(dòng)時(shí)，

9、要對(duì)整個(gè)流程再次進(jìn)行驗(yàn)證，確保流程中每一部分的表現(xiàn)符合要求。如在分子診斷領(lǐng)域或臨床實(shí)驗(yàn)室的其他領(lǐng)域，所有的實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的測(cè)試，對(duì)NGS程序性能分析必須在內(nèi)部進(jìn)行驗(yàn)證后才可應(yīng)用于臨床。二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)平臺(tái)包含很多步驟，非常復(fù)雜。每一步驟應(yīng)分別根據(jù)經(jīng)驗(yàn)綜合決定最佳條件和參數(shù)設(shè)置。這些東西設(shè)置好后，必須進(jìn)行從開(kāi)始到結(jié)束的全部測(cè)試的性能驗(yàn)證，包括實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和生物信息分析平臺(tái)。在驗(yàn)證期間需要確定的重要性能有分析的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度（接近真實(shí)值的程度），精確度（重復(fù)性和可靠性），檢測(cè)極限。對(duì)于任何分子實(shí)驗(yàn)，針對(duì)不同的樣品類(lèi)型（血液、唾液、組織），必須獨(dú)立的進(jìn)行效驗(yàn)。二代測(cè)序檢測(cè)是旨在對(duì)于基因組的多個(gè)大的區(qū)段進(jìn)

10、行詳細(xì)查看。因此，NGS允許檢測(cè)到新的，以及已知的序列變異。因?yàn)闊o(wú)法證實(shí)所有的理論上可能的變異，所以必須將methods-based（其它檢測(cè)方法）和analyte-specific（特定分析物）相結(jié)合，作為驗(yàn)證方法來(lái)判定檢測(cè)的性能。通過(guò)對(duì)已發(fā)表的與NGS平臺(tái)準(zhǔn)確性相關(guān)的文章的咨詢(xún)，將有利于對(duì)自己實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證性工作的認(rèn)知。在大多數(shù)情況下，考慮到桑格測(cè)序是金標(biāo)準(zhǔn)，可以通過(guò)其確定變異位點(diǎn)。然而，在一些情況下變異位點(diǎn)驗(yàn)證信息也可以通過(guò)寡核苷酸微陣列基因分型數(shù)據(jù)獲得。針對(duì)于NGS檢測(cè)，多個(gè)專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)布了關(guān)于分子檢測(cè)驗(yàn)證的指南以供讀者參考。NGS工作組對(duì)于驗(yàn)證性需求中的最小樣品數(shù)進(jìn)行了廣泛深刻的討論。

11、對(duì)于不斷發(fā)展的NGS技術(shù)以及在診斷實(shí)驗(yàn)室多種多樣的應(yīng)用，這種討論為時(shí)過(guò)早。而且存在的問(wèn)題是設(shè)定最小樣品數(shù)對(duì)于NGS診斷來(lái)說(shuō)可能會(huì)導(dǎo)致其驗(yàn)證不足。工作組同時(shí)也注意到對(duì)于已經(jīng)報(bào)道的文章里NGS的驗(yàn)證的樣品數(shù)量有明顯不同（20-80），這表明，individual laboratories are on a validation learning curve.。對(duì)于NGS驗(yàn)證需要運(yùn)行的樣品總數(shù)量主要取決于檢測(cè)的區(qū)域大?。◤募夹g(shù)特性上來(lái)說(shuō)較大的檢測(cè)區(qū)域?qū)?huì)檢測(cè)到更多的變異位點(diǎn)）。根據(jù)特異變異位點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)可能的要求，通過(guò)等位基因頻率范圍，去判定檢測(cè)的限度，根據(jù)樣品運(yùn)行次數(shù)和數(shù)量去設(shè)定其精確度

12、。出于統(tǒng)計(jì)方面考慮，NGS工作組總結(jié)到關(guān)于樣品數(shù)量不能全面或普遍的應(yīng)用于二代測(cè)序的眾多實(shí)驗(yàn)中（如擴(kuò)增子相對(duì)于靶序列捕獲，較少基因量相對(duì)于外顯子組和全基因組，遺傳疾病相對(duì)于腫瘤相對(duì)于傳染病）。因此我們給出多個(gè)腳本（如樣品對(duì)methods-based的處理，對(duì)樣品重復(fù)性和可靠性的評(píng)價(jià)，以及臨床樣本用于評(píng)估診斷特異性敏感度），每一項(xiàng)都將會(huì)需要樣品，而其數(shù)量會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)背景不同而有所變化。以下我們會(huì)突出強(qiáng)調(diào)對(duì)需求量及一些性能分析參數(shù)驗(yàn)證的原則。通過(guò)使用methods-based評(píng)估分析的靈敏度，目的在于最大化突變序列數(shù)量，相對(duì)于金標(biāo)準(zhǔn)增加分析的可信度。這些數(shù)值會(huì)外推到所有的堿基。對(duì)于這種methods-

13、based，致病性變異分析是無(wú)關(guān)的，因?yàn)檫@不受技術(shù)檢測(cè)能力影響。然而盡量多的利用基因組中的不同區(qū)段去判定基線(xiàn)非常重要，因?yàn)樾蛄械谋尘笆且粋€(gè)重要的影響因素。另外實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該分別對(duì)所有的與檢測(cè)相關(guān)的變異類(lèi)型進(jìn)行性能分析判定（如SNV，InDel，CNV，結(jié)構(gòu)變異，homopolymers）。適當(dāng)?shù)拇_定變異類(lèi)型的最大數(shù)量的方法可能會(huì)包含內(nèi)部不同研發(fā)測(cè)試的累積分析，前提是用相同的鑒定工具。另外，幾個(gè)可獲取的公共數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供外顯子組或全基因組變異位點(diǎn)的識(shí)別，以為臨床檢測(cè)服務(wù)。另外疾病預(yù)防控制中心和國(guó)家生物技術(shù)信息中心合作成立網(wǎng)站，以方便兩個(gè)測(cè)序基因組以及臨床靶序列數(shù)據(jù)的獲取。這些數(shù)據(jù)庫(kù)提供了變異位點(diǎn)的大

14、量設(shè)置，這將有助于得到技術(shù)性能規(guī)范。然而當(dāng)NGS檢測(cè)中包含有除了一些更廣泛性的methods-based方法外，一個(gè)特異型分析的驗(yàn)證是有必要的。由此，陽(yáng)性對(duì)照對(duì)于NGS檢測(cè)所熟識(shí)的基因相關(guān)的變異位點(diǎn)（如CFTR基因p.F508缺失變異）引起的疾病極為重要的。特異性分析通常需要陰性樣品進(jìn)行計(jì)算，去定義負(fù)數(shù)部分。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)部分methods-based方法可用于特異性計(jì)算分析，如假陽(yáng)性率的判定。在臨床樣本中它對(duì)于判定假陽(yáng)性數(shù)量同樣具有作用。注意到特異型分析在I類(lèi)錯(cuò)誤類(lèi)型的比例，包括堿基識(shí)別錯(cuò)誤，錯(cuò)位引起的錯(cuò)誤，變異識(shí)別錯(cuò)誤。判定檢測(cè)限對(duì)于一個(gè)含有異質(zhì)基因類(lèi)型的樣品（如腫瘤樣品、用于產(chǎn)前診斷的母親血

15、液，鑲嵌樣品）查詢(xún)的實(shí)驗(yàn)是非常重要的。考慮到桑格測(cè)序過(guò)去一直是在驗(yàn)證期間的金標(biāo)準(zhǔn)，但其靈敏度低于NGS，所以對(duì)NGS的靈敏度驗(yàn)證具有一定挑戰(zhàn)性。樣品混合實(shí)驗(yàn)（已知等位基因頻率的稀釋?zhuān)?yīng)該至少用到3個(gè)樣品（生物學(xué)重復(fù)）。對(duì)于單通道測(cè)序儀，內(nèi)部運(yùn)行的差異性可以通過(guò)用相同樣本的不同條形碼檢測(cè)（技術(shù)重復(fù)）。同源序列如假基因可以干擾變異位點(diǎn)識(shí)別的精確性，這對(duì)正確的去分析受影響的基因形成了巨大的挑戰(zhàn)。預(yù)先生物信息同源性分析將會(huì)有助于確定來(lái)自同源序列可能的干擾。另外，圖譜質(zhì)量可以用于確定有疑問(wèn)的區(qū)域。如果這種基因包含在NGS測(cè)試中，實(shí)驗(yàn)室必須設(shè)計(jì)一個(gè)方法確保被識(shí)別到的變異不是假基因序列，并證明這個(gè)方法的準(zhǔn)確

16、度。當(dāng)測(cè)序池中含有條碼接頭樣品，實(shí)驗(yàn)室必須證明整個(gè)平臺(tái)中樣品身份的保持。重新驗(yàn)證和認(rèn)證的程度依賴(lài)于所引進(jìn)的改變的大小及其潛在的影響。例如一些微小的變化，引進(jìn)新的捕獲試劑并已經(jīng)得到全面的驗(yàn)證，可以通過(guò)預(yù)期達(dá)成的功效進(jìn)行驗(yàn)證。在這個(gè)例子中如果實(shí)驗(yàn)室測(cè)序一個(gè)以前測(cè)試過(guò)的一個(gè)樣品并證明其主要運(yùn)行參數(shù)未改變并獲得了一致的結(jié)果，就可認(rèn)為這種變化是可接受的。相反的，一個(gè)較大的變化，如引進(jìn)了一個(gè)新的測(cè)序平臺(tái)，或不同的靶序列富集方法，那就需要進(jìn)行全面的從新驗(yàn)證。NGS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)質(zhì)量管理體系NGS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)遵循一個(gè)文件化的質(zhì)量管理體系。CAP認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室必須發(fā)展并遵循一個(gè)質(zhì)量管理計(jì)劃。CAP所有的共同的檢測(cè)清單適用于多

17、專(zhuān)科實(shí)驗(yàn)室，包含質(zhì)量管理的各個(gè)部分和性能檢測(cè)方法。NGS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)質(zhì)控管理程序加入到NGS檢測(cè)清單部分，突出NGS實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行的特別需求。沒(méi)有兩個(gè)質(zhì)量管理規(guī)程是相似的。每一個(gè)都是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的范疇、診斷市場(chǎng)、專(zhuān)業(yè)知識(shí)而形成的，并給與實(shí)驗(yàn)室主任寬泛行動(dòng)自由去設(shè)計(jì)質(zhì)量保障體系。質(zhì)量管理規(guī)程的大綱設(shè)計(jì)必須設(shè)計(jì)好，并符合設(shè)計(jì)類(lèi)文件。對(duì)于NGS實(shí)驗(yàn)室，一個(gè)好的質(zhì)量保障大綱應(yīng)包含以下特征：1. 質(zhì)量保障體系應(yīng)遵從工作流程。體系評(píng)價(jià)應(yīng)在二代測(cè)序、分析檢測(cè)、序列報(bào)告分析發(fā)生之前進(jìn)行。2. NGS質(zhì)量體系應(yīng)該與整個(gè)機(jī)構(gòu)的質(zhì)量保障體系相協(xié)調(diào)，如果這個(gè)機(jī)構(gòu)比較大，如醫(yī)院、醫(yī)療中心，NGS的質(zhì)量體系應(yīng)適從于整個(gè)大的體系中。

18、3. 體系應(yīng)該能夠處理在檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的一般性問(wèn)題。這些問(wèn)題不但能夠影響檢測(cè)結(jié)果，而且使得臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)室自身政策規(guī)程不一致。體系文件中應(yīng)包含對(duì)每次校正的記錄、效果、操作準(zhǔn)則、流程的修正，以避免問(wèn)題的復(fù)發(fā)。4. 質(zhì)量管理體系宗旨是確保檢測(cè)具有臨床意義。因?yàn)闆](méi)有靈敏度更高的檢測(cè)進(jìn)行比較，所以這對(duì)于NGS這樣的檢測(cè)尤為重要。檢測(cè)指示和分析判斷的適宜性應(yīng)有科學(xué)的醫(yī)學(xué)證明。5. 規(guī)程中應(yīng)鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室工作人員對(duì)于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量檢測(cè)的意見(jiàn)進(jìn)行交流。對(duì)工作人員的投訴及建議進(jìn)行調(diào)研必須成為質(zhì)量保障體系中的一部分。NGS結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有一項(xiàng)規(guī)定來(lái)文件注明報(bào)告中的變異位點(diǎn)的檢測(cè)驗(yàn)證。雖然NGS技術(shù)的準(zhǔn)確性在不斷提高，

19、但還是普遍認(rèn)為基于NGS的測(cè)序?qū)嶒?yàn)會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果。當(dāng)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)是否要進(jìn)行時(shí)，CAP選擇給開(kāi)展基于NGS測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室一定的靈活性。如檢測(cè)怎樣執(zhí)行，是否建議對(duì)額外的家庭成員進(jìn)行后續(xù)補(bǔ)充檢測(cè)，哪些可以基于二代測(cè)序哪些不可以等。例如，一些實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中測(cè)序深度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)（如基于單基因的二代測(cè)序達(dá)到1000乘），或具有較高的可信度，變異位點(diǎn)就沒(méi)有必要驗(yàn)證確認(rèn)。然而，一些實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為需要另一種可替代的方法對(duì)報(bào)告中的變異位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)，以達(dá)到理想的置信度。另外一些實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)在預(yù)定的試用期進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)，過(guò)后根據(jù)結(jié)果再對(duì)是否進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。每一個(gè)進(jìn)行NGS測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室必須有一項(xiàng)規(guī)程，用

20、來(lái)文件解說(shuō)驗(yàn)證性檢測(cè)工作，或?yàn)楹尾恍枰M(jìn)行驗(yàn)證性工作?；贜GS臨床檢測(cè)及變異位點(diǎn)報(bào)告的實(shí)驗(yàn)室必須能夠文件證明其符合他們的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)規(guī)定，或能夠展示出對(duì)NGS實(shí)驗(yàn)不間斷的監(jiān)控證據(jù)，以保證在驗(yàn)證期間所達(dá)到的基準(zhǔn)能夠一直保持。CAP也希望在決定用何種方法進(jìn)行進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)上給予靈活性。盡管桑格測(cè)序可能是最為普遍的驗(yàn)證方法。CAP這樣做是為了檢驗(yàn)科根據(jù)變異類(lèi)型和頻率靈活的選擇合適的驗(yàn)證性檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)室記錄用于實(shí)驗(yàn)的方法、儀器、試劑以及需要分析的樣品可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)記錄進(jìn)行確認(rèn)追溯。對(duì)于文件證明復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)程序和數(shù)學(xué)算法及對(duì)二代測(cè)序分析性能解釋?zhuān)瑢?shí)驗(yàn)運(yùn)行的綜合完整記錄是必不可少的。因此，首要的工作框架應(yīng)包

21、含對(duì)已歸檔的信息的保存，包括每個(gè)病人樣品分析所用的平臺(tái)，及實(shí)驗(yàn)所用的試劑、引物、測(cè)序反應(yīng)，以便能夠追溯。這些記錄必須包含靶序列檢測(cè)的完成情況及其測(cè)序深度。同時(shí)也有必要記錄分析的細(xì)節(jié)，包括任何報(bào)道或網(wǎng)站對(duì)于相關(guān)參數(shù)的描述，或檢測(cè)和報(bào)告處理中一些其他信息。雖然所有的分析細(xì)節(jié)不必包含在病人的報(bào)告中，但是實(shí)驗(yàn)室保存每位病人分析相關(guān)的詳細(xì)信息的文件系統(tǒng)是極為關(guān)鍵重要的。異常記錄實(shí)驗(yàn)室保存來(lái)自于NGS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)SOP偏差的病人樣本的異常記錄。實(shí)驗(yàn)室必須文件記錄下任何源自SOP的偏差，并對(duì)偏差及產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行解釋。樣品預(yù)期的偏差可能包括對(duì)收到的樣品或構(gòu)建的文庫(kù)未達(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)，以及測(cè)序文庫(kù)的濃度未達(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)。異常

22、情況可能會(huì)與樣品質(zhì)量以及分析過(guò)程有關(guān)，在樣本登記時(shí)，需要對(duì)樣品作出評(píng)價(jià)以便判斷這例樣品是否適合進(jìn)行檢驗(yàn)。如果對(duì)某一例樣品質(zhì)量有一絲擔(dān)心，應(yīng)記錄在工作單中，并就其與監(jiān)管者或?qū)嶒?yàn)室主任進(jìn)行交流。實(shí)驗(yàn)室主任可能會(huì)繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)，但會(huì)將這問(wèn)題傳達(dá)給主治醫(yī)師，并就此進(jìn)行討論交流。這種情況的一個(gè)案例就是沒(méi)有在最佳的條件下進(jìn)行樣品運(yùn)輸。對(duì)于這例樣品的處理決定一般是只有當(dāng)提取的DNA充足時(shí)才會(huì)進(jìn)行下一步的檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，與具體步驟相關(guān)的問(wèn)題應(yīng)報(bào)告給實(shí)驗(yàn)室主管或主任。然后才能對(duì)檢測(cè)能否完成進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)故障排出之后，如果質(zhì)控運(yùn)行及樣品結(jié)果合適，結(jié)果可以被實(shí)驗(yàn)室主管解讀，檢測(cè)結(jié)果是令人滿(mǎn)意的。檢測(cè)問(wèn)題的方方面

23、面都應(yīng)完整的記錄在異常文件里，包括故障排除，解決方案，以及相關(guān)的交流（誰(shuí)與誰(shuí)及日期），這些必須并入到月質(zhì)量保障報(bào)告中。有時(shí)，實(shí)驗(yàn)室SOP自身需要進(jìn)行修改以改善措辭，使得工序流程更清楚，或者是去除小的誤差完善操作流程。在這種情況下，所推薦的修改至少應(yīng)有兩個(gè)人的支持，包括開(kāi)發(fā)此項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室主管和及實(shí)驗(yàn)工程師或相關(guān)專(zhuān)家。在這類(lèi)修改中，必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室主任核準(zhǔn)，簽字署名，注明日期。本質(zhì)上這并不是一個(gè)異常記錄，而是一個(gè)對(duì)實(shí)驗(yàn)描述的更正。監(jiān)控升級(jí)用以產(chǎn)生NGS數(shù)據(jù)的儀器，測(cè)序化學(xué)反應(yīng)，試劑或試劑盒等，其相應(yīng)的監(jiān)控、執(zhí)行、文件記載的升級(jí)，實(shí)驗(yàn)室需加以規(guī)范。實(shí)驗(yàn)室必須意識(shí)到升級(jí)，確保沒(méi)有在用廢棄掉的方法。實(shí)驗(yàn)室

24、必須出具相關(guān)政策方案去監(jiān)管和執(zhí)行儀器，測(cè)序化學(xué)反應(yīng)，試劑或試劑盒等的升級(jí)。已經(jīng)驗(yàn)證的可以提高片段擴(kuò)增及測(cè)序的質(zhì)量、再現(xiàn)性、準(zhǔn)確性的一些新的方法不斷地更新發(fā)展，這項(xiàng)規(guī)范應(yīng)解決NGS測(cè)序的實(shí)驗(yàn)室去如何確保他們所用的樣品文庫(kù)制備實(shí)驗(yàn)是最新的。這項(xiàng)規(guī)范也應(yīng)說(shuō)明監(jiān)管升級(jí)所用的方法以及何時(shí)執(zhí)行一個(gè)相關(guān)的升級(jí)并在臨床應(yīng)用前進(jìn)一步驗(yàn)證。例如實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范應(yīng)在指定的間隔期（如一季度、半年、一年）進(jìn)行監(jiān)控并執(zhí)行升級(jí)，以增強(qiáng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)性能。此外，執(zhí)行完升級(jí)后可能會(huì)需要對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)或相關(guān)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行重新驗(yàn)證，相應(yīng)的設(shè)定時(shí)間間隔期會(huì)更方便。生物信息分析過(guò)程對(duì)于NGS數(shù)據(jù)的分析，各種開(kāi)源代碼和商業(yè)的生物信息學(xué)算法和軟件都

25、是可獲得的。雖然這些分析工具在不斷改善，他們?cè)谠\斷分析性能方面都有其強(qiáng)項(xiàng)和弱項(xiàng)。在操作上，適用于NGS數(shù)據(jù)的生物分析過(guò)程可以總結(jié)為3個(gè)主要步驟。第一步是產(chǎn)生一個(gè)包含核酸序列的可讀文件，每個(gè)核苷酸都標(biāo)定一個(gè)與準(zhǔn)確性相關(guān)的數(shù)值（堿基質(zhì)量分值）。產(chǎn)生的序列文件利用特定儀器軟件分析幾個(gè)基礎(chǔ)參數(shù)，如運(yùn)行時(shí)的信噪比。序列文件一般以FASTQ文件格式生成，包含每個(gè)讀取的堿基種類(lèi)，自身的標(biāo)識(shí)以及每個(gè)核苷酸相應(yīng)的質(zhì)量分值。FASTQ文件已經(jīng)變成廣泛認(rèn)可的格式用以NGS領(lǐng)域的信息交流。下一步主要是根據(jù)參考序列，對(duì)讀取的序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)于一個(gè)典型的人類(lèi)參考基因組序列，去確定病人的序列與參考序列之間的不同。鑒定的變異

26、類(lèi)型包含SNV、InDel、CNV以及其它的結(jié)構(gòu)變異。確定的變異根據(jù)相應(yīng)基因或蛋白的功能注釋到提供信息中。另外實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行或策劃研發(fā)的獨(dú)立程序，對(duì)特定變異與給出的疾病的臨床相關(guān)性予以評(píng)價(jià)。最后，在遞交的臨床報(bào)告中，通過(guò)注釋的變異位點(diǎn)解讀病人的臨床表型。對(duì)于基因模塊和外顯子組或全基因組測(cè)序，大量變異位點(diǎn)的的排查可以通過(guò)對(duì)較高的基因型頻率來(lái)篩減，最后只關(guān)注于極有可能對(duì)病人有危害并與病癥相關(guān)的的稀有變異。當(dāng)以家庭為單位對(duì)外顯子組或全基因組進(jìn)行分析時(shí)，根據(jù)受影響與不受影響的家庭成員，優(yōu)先考慮變異類(lèi)型在家族中的共分離。根據(jù)人類(lèi)基因組突變體數(shù)據(jù)庫(kù)（如HGMD、OMIM等）與變異相關(guān)的疾病的相關(guān)信息對(duì)變異類(lèi)型

27、進(jìn)行等級(jí)劃分，形成臨床報(bào)告。開(kāi)發(fā)一個(gè)包含生物信息以及對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行研究注釋的綜合型診斷流水線(xiàn)，需要整合多個(gè)算法和軟件應(yīng)用。就本身來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)室必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇算法以及軟件工具應(yīng)用到每個(gè)分析診斷中。其中多個(gè)中間過(guò)程需要已知的病人樣本和培訓(xùn)數(shù)據(jù)進(jìn)行設(shè)置，去檢測(cè)算法和軟件的性能。已經(jīng)制定好的生物信息分析工具和參數(shù)設(shè)置，實(shí)驗(yàn)室需執(zhí)行生物信息分析驗(yàn)證，通過(guò)大量的設(shè)定的樣本判定分析的靈敏度、特異性和重復(fù)性（不同運(yùn)行，不同儀器，不同操作人員之間的一致性）。用以驗(yàn)證的樣品包含以前已經(jīng)確認(rèn)過(guò)的變異類(lèi)型。這些變異可以驗(yàn)證生物信息工具及其參數(shù)的性能表現(xiàn)（例如，如果對(duì)變異的檢測(cè)是獨(dú)立的分析，應(yīng)有較高的特異性和靈敏度，或

28、如果是二次分析進(jìn)行篩選的實(shí)驗(yàn)，需相對(duì)較高的靈敏度），按照每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的要求和報(bào)告的臨床標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)整或更換工具并進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)一個(gè)令人滿(mǎn)意的生物信息程序經(jīng)驗(yàn)證并達(dá)標(biāo)后，NGS實(shí)驗(yàn)結(jié)果向臨床的轉(zhuǎn)化需要實(shí)驗(yàn)室將生物信息分析的過(guò)程的所有方面進(jìn)行記錄描述，并對(duì)此制定一個(gè)質(zhì)量管理體系。對(duì)生物信息分析的要求在下面的討論中將著重講解。NGS生物信息分析標(biāo)準(zhǔn)操作流程文件實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過(guò)SOP的形式對(duì)于生物分析中NGS結(jié)果的分析注釋及報(bào)告等流程進(jìn)行文件化。實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)在NGS結(jié)果的分析注釋及報(bào)告中所用到的算法、軟件、數(shù)據(jù)資料庫(kù)進(jìn)行文件化。生物信息分析流程的每一組成部分的文本必須記錄并能夠追溯（版本控制）。對(duì)于每一組成

29、部分，實(shí)驗(yàn)室會(huì)用到一個(gè)基線(xiàn)，默認(rèn)安裝，在發(fā)布的個(gè)體的生物信息學(xué)工具或運(yùn)行算法方面，利用可替換的配置參數(shù)定制路徑。無(wú)論哪種情況，實(shí)驗(yàn)室必須以文件形式記錄所有的與默認(rèn)設(shè)置不同的自定義內(nèi)容或者明確指明所用到的參數(shù)、路徑、數(shù)值等。大部分的生物信息分析通過(guò)與參考序列進(jìn)行比對(duì)，參考序列的版本號(hào)及組裝的詳細(xì)信息都需要明確指出。當(dāng)描述生物信息路徑時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該以文件的形式記錄所有的數(shù)據(jù)分析，包括每一步輸入和輸出的文件。對(duì)于每一步的正常表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該也制定和記錄質(zhì)控參數(shù)。例如，首要步驟，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室會(huì)決定采納一套標(biāo)準(zhǔn)，如特定儀器質(zhì)量過(guò)濾后，通過(guò)的可讀序列數(shù)量。變異位點(diǎn)識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)是必不可少的，用到的參數(shù)閾值包含測(cè)

30、序深度，變異位點(diǎn)質(zhì)量評(píng)分，等位基因讀取比率。在后期數(shù)據(jù)篩選的流程和依據(jù)也需要體現(xiàn)在SOP文件中。NGS生物信息分析流程驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室對(duì)生物信息分析的驗(yàn)證生效以及當(dāng)有變動(dòng)時(shí)對(duì)整個(gè)分析流程或流程的一部分性能進(jìn)行從新驗(yàn)證生效。從新認(rèn)證的程度范圍由修改變動(dòng)內(nèi)容而定。正如實(shí)驗(yàn)流程一樣，在確立一個(gè)包含序列分析可讀文件的生物信息分析流程時(shí)，實(shí)驗(yàn)室會(huì)經(jīng)歷一個(gè)自身不斷修正的過(guò)程。對(duì)于能夠完成從測(cè)序?qū)嶒?yàn)到生物信息分析的整個(gè)流程的實(shí)驗(yàn)室，生物信息分析路徑的驗(yàn)證生效應(yīng)該包含整體的驗(yàn)證。一旦實(shí)驗(yàn)室形成并經(jīng)驗(yàn)性的確定了最佳操作，并對(duì)流程完成了充足的檢測(cè)，下一步就是再利用含有變異位點(diǎn)的樣品產(chǎn)生的序列執(zhí)行并文件化，進(jìn)行全面的驗(yàn)證

31、。對(duì)于內(nèi)部研發(fā)的軟件工具或供應(yīng)商提供的已經(jīng)鎖定的軟件工具（如對(duì)基礎(chǔ)工具沒(méi)有進(jìn)行任何修改），這些步驟是必不可少的。對(duì)于實(shí)驗(yàn)測(cè)序平臺(tái)，需要對(duì)充足的樣品數(shù)量進(jìn)行分析，去評(píng)價(jià)其診斷分析的靈敏性，特異性和重復(fù)性。樣本數(shù)量的評(píng)估應(yīng)由實(shí)驗(yàn)本身決定。一些參數(shù)如基因數(shù)量的評(píng)估，基因區(qū)域的評(píng)估，以及需要檢測(cè)的變異類(lèi)型最終都應(yīng)確認(rèn)控制的數(shù)量，良好的特征樣品（例如人類(lèi)基因組單體型圖樣本或已知的固有的細(xì)胞系或設(shè)計(jì)的變異），或之前診斷過(guò)的樣品。眾所周知，假基因以及與靶序列高度同源的序列的出現(xiàn)對(duì)與精確的序列圖譜映射，序列比對(duì)，及相關(guān)的變異識(shí)別都有干擾。在一個(gè)給定的臨床診斷實(shí)驗(yàn)中，需要對(duì)干擾的程度進(jìn)行判定。盡管在生物信息分析

32、上高度同源序列的設(shè)置調(diào)整的挑戰(zhàn)，可能會(huì)解決掉，但是實(shí)驗(yàn)室仍需要設(shè)置一個(gè)獨(dú)立的可替代性分析方法去應(yīng)對(duì)這一領(lǐng)域的問(wèn)題。NGS工作組認(rèn)為全面詳盡的定義假陽(yáng)性和假陰性對(duì)應(yīng)的錯(cuò)誤率是不可行的。然而實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該在變異類(lèi)型上對(duì)典型的實(shí)例的錯(cuò)誤率進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)對(duì)照樣品、特征樣品可以對(duì)這些錯(cuò)誤率進(jìn)行評(píng)估。假陽(yáng)性的錯(cuò)誤率可以通過(guò)可替代性的測(cè)序方法進(jìn)行確定。假陰性的錯(cuò)誤率很難確定，因?yàn)槠淦鹪从诙喾N情況，包括在給定靶區(qū)域內(nèi)測(cè)序深度的不足，變異的識(shí)別的缺少可能因?yàn)橘|(zhì)量評(píng)分設(shè)置較低，序列讀取的方向分布（正向、反向）無(wú)法滿(mǎn)足質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。在用一個(gè)可替代方法驗(yàn)證變異識(shí)別的過(guò)程中，通過(guò)分析靶序列的側(cè)翼區(qū)域去確定這個(gè)變異識(shí)別流程能否發(fā)

33、現(xiàn)所有可能的變異。例如，當(dāng)用桑格測(cè)序確認(rèn)一個(gè)變異時(shí)，可以設(shè)計(jì)引物對(duì)，不僅對(duì)變異區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，而且對(duì)側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)序，然后就能檢測(cè)是否存在變異，查找與生物信息分析途徑鑒定結(jié)果的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在文庫(kù)制備時(shí)，應(yīng)用分子編碼已成為NGS中的常用做法。實(shí)驗(yàn)室需要確定標(biāo)簽序列在混合池中的特異性，并且確認(rèn)在分析的過(guò)程中，能夠準(zhǔn)確的識(shí)別區(qū)分標(biāo)簽序列。在索引分析和樣品合并時(shí)，接收或拒絕一條讀長(zhǎng)需要設(shè)立一標(biāo)準(zhǔn)。例如一些實(shí)驗(yàn)室只接受具有索引的讀長(zhǎng)，且索引序列與建庫(kù)時(shí)所用索引是一致的。對(duì)于含有索引序列的讀取量的百分?jǐn)?shù)的監(jiān)測(cè)可以測(cè)試出來(lái)源于其它索引序列污染的存在。這個(gè)測(cè)試與檢測(cè)限相關(guān)，如在腫瘤樣品中確認(rèn)體細(xì)胞突變，生物信息分

34、析途徑需要其參數(shù)進(jìn)行評(píng)估?？梢酝ㄟ^(guò)降低含有變異位點(diǎn)的樣品濃度驗(yàn)證其檢測(cè)極限。對(duì)于確認(rèn)變異位點(diǎn)的生物信息分析途徑的驗(yàn)證都是專(zhuān)用的，除了分析含有雜合基因型的特殊樣品的檢測(cè)極限外，以上討論都是與之廣泛相關(guān)的。當(dāng)應(yīng)用外顯子或全基因組測(cè)序以確認(rèn)相關(guān)的候選基因時(shí)，基于此，實(shí)驗(yàn)室必須額外的對(duì)生物分析途徑進(jìn)行驗(yàn)證。例如，在遺傳疾病的情況下，實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)具有多種（隱性、顯性、有害變異、致病性變異）序列分析讀取設(shè)置。一旦生物信息分析途徑經(jīng)過(guò)驗(yàn)證符合實(shí)驗(yàn)室的要求，并已經(jīng)實(shí)施，當(dāng)分析途徑有任何改變時(shí)，需要對(duì)其重新驗(yàn)證。能夠使其重新生效的實(shí)際方法是利用分析驗(yàn)證過(guò)的序列文件用新參數(shù)對(duì)其重新簡(jiǎn)單地分析。這種方法可能會(huì)產(chǎn)生相

35、同的、或更少的、或更多的變異位點(diǎn)，這些結(jié)果需要進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)于外顯子組或全基因組的序列，生物分析途徑的改變也能產(chǎn)生一個(gè)新的假定的候選基因名單。作為生物分析途徑驗(yàn)證或從新驗(yàn)證的法規(guī)資料將會(huì)包含驗(yàn)證生效記錄和臨床應(yīng)用的備用證明文件。NGS信息分析流程-質(zhì)量管理體系對(duì)于NGS信息分析途徑，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有一份文件化的質(zhì)量控制體系。實(shí)驗(yàn)室必須依據(jù)對(duì)應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)來(lái)監(jiān)測(cè)NGS數(shù)據(jù)分析的常規(guī)性工作。對(duì)臨床樣品分析時(shí)，與預(yù)期的質(zhì)量控制指標(biāo)的偏離需要調(diào)查，并給出解決。一些樣品包含以下這些情況：NGS數(shù)據(jù)分析的生物信息輸出可能會(huì)顯示通過(guò)質(zhì)量評(píng)分要求的序列讀取數(shù)量的不足。另一種情況，根據(jù)人類(lèi)基因組突變頻率的相關(guān)信息，確定

36、的變異的數(shù)量可能會(huì)脫離實(shí)際期望值。另外的樣品具有偏高的索引序列讀取的數(shù)量，以至于無(wú)法專(zhuān)門(mén)的分離。這種偏差表明技術(shù)上存在誤差，或操作過(guò)程的失誤。一個(gè)合適的質(zhì)量控制系統(tǒng)提供工作流程，去查明導(dǎo)致差錯(cuò)的可能的原因，并制定合適的補(bǔ)救措施。如與預(yù)期結(jié)果相偏差，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)記錄下來(lái)，并以文獻(xiàn)的形式記錄用來(lái)確定原因和修正的相關(guān)措施。遵從的證據(jù)（法規(guī)資料）不僅應(yīng)包含質(zhì)量控制監(jiān)測(cè)指標(biāo)的文件編制，還應(yīng)有關(guān)于偏差及相應(yīng)研究和補(bǔ)救措施的記錄描述。生物信息流程的更新實(shí)驗(yàn)室有一個(gè)政策針對(duì)監(jiān)控，文件編制，補(bǔ)丁版本的執(zhí)行，升級(jí)和其它生物信息分析途徑的更新。檢測(cè)項(xiàng)目要求實(shí)驗(yàn)室制定并遵循一項(xiàng)程序，對(duì)生物分析途徑的各部分制定和實(shí)施更新。

37、二代測(cè)序生物分析途徑常常會(huì)用到開(kāi)源代碼軟件的多個(gè)程序包，處理內(nèi)容、報(bào)告分析方面的數(shù)據(jù)庫(kù)。由于這一領(lǐng)域的不斷改進(jìn)演變，實(shí)驗(yàn)室必須有一項(xiàng)政策監(jiān)控更新，版本補(bǔ)充。這項(xiàng)政策應(yīng)該注明更新的日期。例如，實(shí)驗(yàn)室在相關(guān)發(fā)布后就執(zhí)行更新，或在一定的間隔期（一季度，半年，一年）后進(jìn)行更新，這由更新的性質(zhì)和相關(guān)緊迫性決定。由于在這些更新后需要對(duì)生物信息分析流程重新驗(yàn)證生效，后一種方法使得更新與重新驗(yàn)證合并，這將是更有效的。最后實(shí)驗(yàn)室保存記錄，并能清晰地以文件的形式記錄定期的監(jiān)管執(zhí)行更新。應(yīng)著重強(qiáng)調(diào)的是，是否更新，何時(shí)更新，是由實(shí)驗(yàn)室主任決定。數(shù)據(jù)儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)室有一個(gè)規(guī)定，與生物信息分析途徑產(chǎn)出的數(shù)據(jù)，中間的數(shù)據(jù)，以及最

38、終的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室必須確立并執(zhí)行關(guān)于數(shù)據(jù)儲(chǔ)存的一項(xiàng)規(guī)定。NGS產(chǎn)生的大的數(shù)據(jù)文件以及相關(guān)的數(shù)據(jù)分析，包括流動(dòng)細(xì)胞成像文件，序列堿基識(shí)別和相應(yīng)質(zhì)量評(píng)分序列讀取文件，以及隨后分析中產(chǎn)生的中間文件。通常在一段較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保存所有的文件是不實(shí)際的，所以清單要求授權(quán)實(shí)驗(yàn)室確立一項(xiàng)關(guān)于數(shù)據(jù)儲(chǔ)存的規(guī)定，指定的數(shù)據(jù)文件保留時(shí)間，及最終報(bào)告之后哪些文件需要保存。NGS工作組建議，如果可行的話(huà)，實(shí)驗(yàn)室保留含有質(zhì)量評(píng)分的序列文件（如FASTQ文件）或保存一個(gè)能夠再生的文件檔案（如BAM文件）。這些格式將會(huì)允許在后來(lái)重新分析。對(duì)于全基因組或其它較大的序列數(shù)據(jù)，保留FASTQ文件或標(biāo)準(zhǔn)檔案格式較長(zhǎng)時(shí)間將會(huì)花費(fèi)較高的

39、費(fèi)用，然而，新的壓縮格式提供了一個(gè)近期的解決方案。這些文件要保存多長(zhǎng)時(shí)間是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，與文件大小，實(shí)驗(yàn)室文件儲(chǔ)存能力，法醫(yī)學(xué)考慮，地方、地區(qū)、國(guó)家對(duì)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存的要求。最后必須強(qiáng)調(diào)數(shù)據(jù)文件的儲(chǔ)存時(shí)間與地方、地區(qū)、國(guó)家對(duì)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存的要求保持一致。版本的可追溯性利用NGS數(shù)據(jù)文件，生物信息分析途徑的特定的版本對(duì)于每個(gè)病人的報(bào)告都是可以追溯的。用于NGS數(shù)據(jù)分析的特定版本的組成部分，從哪獲得，相關(guān)的配制（命令行參數(shù)或其它配制項(xiàng)）都能夠被追溯。之前已經(jīng)提到，對(duì)于應(yīng)用生物信息分析流程去分析NGS數(shù)據(jù)，尤其是主要基于開(kāi)源代碼的軟件時(shí)，其經(jīng)常由多個(gè)程序包、腳本、數(shù)據(jù)庫(kù)組成。單個(gè)的軟件包或腳本性能，內(nèi)置的或外部

40、的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于整個(gè)生物信息分析的性能具有重要的影響。因此，利用特定的生物分析流程對(duì)每個(gè)病人的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并生成報(bào)告是極為重要的。對(duì)于內(nèi)部產(chǎn)生的腳本和軟件包，如有改動(dòng)也應(yīng)以文件形式記錄，但是這些不必要出現(xiàn)在病人的報(bào)告中。總的來(lái)說(shuō)，應(yīng)用特定實(shí)驗(yàn)室指定的分析流程（如：NGS流程V1.0.1）作為參考是可以被接受的。對(duì)于單個(gè)的組件和配置的組合，特定實(shí)驗(yàn)室指定的流程應(yīng)該是獨(dú)一無(wú)二的。因此，軟件程序包、腳本、或內(nèi)部外部的數(shù)據(jù)庫(kù)的不同的版本的改變，需要一個(gè)新的獨(dú)特的特定實(shí)驗(yàn)室并對(duì)其重新驗(yàn)證。異常記錄實(shí)驗(yàn)室利用生物信息分析流程分析過(guò)程中，對(duì)病人案例的偏離SOP的異常日志進(jìn)行保存維護(hù)。在生物信息分析流程分析過(guò)程

41、中，與SOP有任何的差異都應(yīng)該以文件從形式記錄在異常日志中，包括軟件包、腳本、版本號(hào)、數(shù)據(jù)庫(kù)、命令行或相關(guān)參數(shù)的改變。在生物信息分析流程分析過(guò)程中，任何運(yùn)行失敗都應(yīng)記錄在異常日志中，包括問(wèn)題，結(jié)果調(diào)查，所進(jìn)行的修改，相互的交流，實(shí)驗(yàn)室主任的簽署，委派人員等。異常日志要求與病人的報(bào)告保持聯(lián)系，實(shí)驗(yàn)室主任可以選擇任何相關(guān)的SOP偏差與咨詢(xún)醫(yī)師進(jìn)行交流。異常日志的文件化也應(yīng)并入到質(zhì)量保障月報(bào)告中。一些偏差，例如由于網(wǎng)絡(luò)、電腦或儲(chǔ)存失敗需從新運(yùn)行的，或需要不同的參數(shù)運(yùn)行一個(gè)特定的步驟，必須文件記錄其結(jié)果輸出和解釋。例如，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)需要在特定工具里改變?cè)O(shè)置以充分的對(duì)一個(gè)病例的某一變異或基因區(qū)域進(jìn)行

42、充分的分析。偏差的原因的描述，以及產(chǎn)生偏差的特殊部分應(yīng)記錄在異常日志中。每一個(gè)偏差應(yīng)鏈接到對(duì)應(yīng)病人案例中，由實(shí)驗(yàn)室主任給出恰當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)。由于有擔(dān)保，這種偏差可以包含在最終的報(bào)告中，或詳細(xì)的與咨詢(xún)醫(yī)師進(jìn)行交流。在進(jìn)行生物信息分析時(shí)與漏洞或故障相關(guān)的偏差需要記錄在異常日志中。漏洞、受影響的案例，提出的矯正措施，必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室主任審核批準(zhǔn)，簽字，注明日期?？赡苡捎谟布蜍浖虿僮魇д`導(dǎo)致生物信息分析完全的失敗，也應(yīng)該記錄在異常日志中，并以文件形式記錄出現(xiàn)的錯(cuò)誤。NGS數(shù)據(jù)傳送的保密性實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有一項(xiàng)規(guī)程，在NGS數(shù)據(jù)在內(nèi)部或外部的儲(chǔ)存、傳送時(shí)保持時(shí)，應(yīng)確保病人信息的保密和安全。二代測(cè)序產(chǎn)生的大量的數(shù)據(jù)，

43、尤其是基因測(cè)序，含有病人的姓名，出生日期，用藥數(shù)量記錄或其他的受保護(hù)的健康信息，用以對(duì)病人的身份鑒定。實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的程序確保病人的私人信息受到保護(hù)。實(shí)驗(yàn)室必須強(qiáng)化一些關(guān)于基因組信息傳送給醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)或第三方機(jī)構(gòu)（如提供云計(jì)算資源或?qū)嶒?yàn)室服務(wù)類(lèi)的機(jī)構(gòu)）的規(guī)程。規(guī)程中應(yīng)包括數(shù)據(jù)加密，安全數(shù)據(jù)傳送，訪(fǎng)問(wèn)時(shí)的用戶(hù)身份識(shí)別鑒定。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該遵照健康保險(xiǎn)攜帶和賬戶(hù)行為能力的標(biāo)準(zhǔn)要求，例如與外部供應(yīng)商建立商業(yè)協(xié)議，包括嚴(yán)格的充分的評(píng)估合適的方法保障病人臨床基因組數(shù)據(jù)發(fā)送和接收的機(jī)密性。序列變異位點(diǎn)的解釋報(bào)告對(duì)變異位點(diǎn)的解釋和報(bào)告應(yīng)遵循專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)推薦的指導(dǎo)方針。隨著NGS技術(shù)的采用，臨床實(shí)驗(yàn)室正在擴(kuò)大他們的

44、檢測(cè)項(xiàng)目名單，如從單基因到基因模塊再到外顯子組，再到全基因組。顯而易見(jiàn)的，實(shí)驗(yàn)室將對(duì)多個(gè)關(guān)鍵的在以前報(bào)道中引起疾病的變異位點(diǎn)進(jìn)行NGS測(cè)序。目前，大部分的基因變異的實(shí)驗(yàn)報(bào)告都是遵循人類(lèi)基因組變異協(xié)會(huì)命名法以及來(lái)自美國(guó)遺傳醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)（ACMG）的變異分類(lèi)指導(dǎo)方針。術(shù)語(yǔ)命名的參考最初由Antonarakis和Dunnen在2001年發(fā)布，但目前已經(jīng)發(fā)生顯著地變化及附加上一些內(nèi)容。因此，建議實(shí)驗(yàn)室采用這些參考指南的最新網(wǎng)絡(luò)版本。ACMG的變異分類(lèi)的參考方針目前正在修訂，新版本將包含變異位點(diǎn)的解釋的參考內(nèi)容。建議應(yīng)用ACMG的對(duì)于遺傳疾病的分類(lèi)系統(tǒng)作為參考，以提高變異位點(diǎn)分類(lèi)的一致性。疾病和基因特異性修

45、飾將應(yīng)該記錄在案。對(duì)于其他臨床基因組檢測(cè)（腫瘤或病原體診斷），實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對(duì)變異分類(lèi)持有最佳的判斷，并采納現(xiàn)有的參考指南。在一些文獻(xiàn)中存在混淆的地方，如何使用副本文字進(jìn)行變異的編號(hào)缺乏一致性，在臨床報(bào)告中也是如此。如由基因MUTYH產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，利用復(fù)雜的命名法去描述基因中的突變位點(diǎn)。其中兩個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄本是hMYHa1（NM-.2）和hMYHa3（NM-.1），由546和535個(gè)氨基酸組成的多肽。由于第3外顯子的可變剪切造成hMYHa3比hMYHa3少33個(gè)核苷酸，修剪掉第3外顯子5端11個(gè)氨基酸（GMIAECPGAPA）。大多數(shù)文獻(xiàn)命名突變體時(shí)用的是hMYHa3，然而一些文獻(xiàn)利用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本

46、hMYHa1進(jìn)行命名。當(dāng)對(duì)基因MUTYH出具檢測(cè)報(bào)告時(shí)，或來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)其的報(bào)告進(jìn)行比較時(shí)，注明應(yīng)用哪一個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行命名是極為重要的。實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將這兩個(gè)最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄本命名為p.Tyr165Cys和p.Gly382Asp。在臨床報(bào)告中，當(dāng)有名稱(chēng)變化時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有一套機(jī)制去監(jiān)管此類(lèi)事情，并給予高度的重視。因此為了避免混淆，報(bào)告中要注釋所用轉(zhuǎn)錄本的檢索號(hào)及對(duì)應(yīng)的蛋白排列。在一個(gè)樣本中，對(duì)序列變異的觀(guān)察的精確解釋對(duì)于臨床檢測(cè)是極為重要的，因?yàn)樗狭俗儺悓?duì)于功能基因所有可能的破壞和病人的臨床表型，以確定是否是這個(gè)變異引起的疾病。在過(guò)去的幾年里，不同的名詞術(shù)語(yǔ)已經(jīng)應(yīng)用到臨床報(bào)告中，這意味著測(cè)序結(jié)果在

47、不斷變化，包括致病性的，有害的，疾病相關(guān)聯(lián)的，并帶有possible，probably，likely，VUS和VOUS（未知的臨床意義，未確定的臨床意義）修飾詞。標(biāo)準(zhǔn)的序列變異參考已經(jīng)推薦給遺傳類(lèi)疾病，但對(duì)于腫瘤和傳染性病原體診斷仍然是不牢靠的。對(duì)于遺傳疾病，最普遍的應(yīng)用的分類(lèi)分為5個(gè)類(lèi)別，（1）致病性的，（2）可能致病性的，（3）不確定的臨床意義，（4）可能良性的（5）良性的。當(dāng)描述序列變異造成的臨床影響時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)引起重視，并仔細(xì)的考慮疾病因果關(guān)系的證據(jù)，普通人群中的頻率，以及相關(guān)功能性研究。從大的工程項(xiàng)目（外顯子組變異服務(wù)器，千人基因組計(jì)劃等）里免費(fèi)的獲得外顯子組或全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)后，實(shí)

48、驗(yàn)室應(yīng)該利用相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)和計(jì)算機(jī)工具（如表所示）去注釋序列改變對(duì)疾病的影響程度。對(duì)于大規(guī)模的檢測(cè)，如外顯子測(cè)序或全基因組測(cè)序，一個(gè)基因?qū)膊〉囊蚬P(guān)系的證據(jù)的評(píng)價(jià)，以及對(duì)變異類(lèi)型、遺傳形式的理解是非常重要的。例如沒(méi)有確定在發(fā)病中有具體作用的一個(gè)基因的功能性缺失變異，不可以假設(shè)其引起疾病。附帶性遺傳研究報(bào)告與臨床診斷目的無(wú)關(guān)的附帶性遺傳研究報(bào)告，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)此進(jìn)行規(guī)范。當(dāng)進(jìn)行單基因、基因模塊、外顯子、全基因組測(cè)序測(cè)序時(shí)，臨床上會(huì)產(chǎn)生重要的遺傳研究發(fā)現(xiàn)，但與檢測(cè)的表現(xiàn)型無(wú)關(guān)。這種現(xiàn)象同樣也會(huì)出現(xiàn)在對(duì)某種特定疾病進(jìn)行特定分析的情況中。其可能會(huì)包含識(shí)別與常染色體顯性疾病，隱性疾病攜帶狀態(tài)，普遍已知的藥物

49、反應(yīng)等位基因標(biāo)記有關(guān)的變異。著手利用NGS的臨床檢測(cè)，應(yīng)該意識(shí)到這種偶然的研究發(fā)現(xiàn)的潛力，并且對(duì)于是否以及如何報(bào)告這些這些實(shí)驗(yàn)檢測(cè)應(yīng)該有相關(guān)規(guī)定。最近公布的ACMG推薦規(guī)范，去報(bào)告醫(yī)學(xué)上可操作的偶然發(fā)現(xiàn)，其中包含一個(gè)最低量的基因名單，如果發(fā)現(xiàn)已知的突變位點(diǎn)，就應(yīng)出具其報(bào)告。實(shí)驗(yàn)室可以選擇遵循ACMG的推薦，但并不是期望一定要報(bào)告在這些基因中的發(fā)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)室就偶然的發(fā)現(xiàn)，可以制定自己的規(guī)范。如果實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范不對(duì)偶然性發(fā)現(xiàn)進(jìn)行報(bào)道，或者限制對(duì)一特定疾病報(bào)告偶然的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該清楚在檢測(cè)報(bào)告中聲明。當(dāng)決定是否透漏給病人某一遺傳信息時(shí)，道德準(zhǔn)則也應(yīng)考慮進(jìn)來(lái)。公開(kāi)附帶性發(fā)現(xiàn)相關(guān)的安全等級(jí)由疾病的嚴(yán)重程度、臨床可控程度、或其它風(fēng)險(xiǎn)效益因子決定。例如，常見(jiàn)的疾病風(fēng)險(xiǎn)等位基因，2型糖尿病，相較于遺傳信息表明傾向于醫(yī)學(xué)上可以或不可以治愈的惡性腫瘤或孟德?tīng)栠z傳病而言，具有相對(duì)較低的風(fēng)險(xiǎn)，或藥理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)信息具有不同后果嚴(yán)重程度。所有的這些方面在將信息反