擴(kuò)增產(chǎn)物的分析方法

1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析方法 微孔板夾心雜交法 顏色互補(bǔ)分析法 PCR-ELISA法 PCR-OLA法 PCR-打點(diǎn)雜交法 微孔板夾心雜交法：該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特 異雜交使產(chǎn)物的間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測(cè)探針與產(chǎn)物的另一特異性較一次 雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果。該法需要兩個(gè)雜交過程來檢測(cè) 一個(gè)產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測(cè)法高。該法已用于HBV 的檢測(cè)，其敏感度可達(dá)5個(gè)HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的Southern雜交法相當(dāng)。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡(jiǎn) 便、快速、避免了同位素標(biāo)

2、記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常 規(guī)應(yīng)用的ELISA，適于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。另一種微孔板雜交法不 是采用夾心法，而是直接將特異探針固定微孔板上，然后用生物素 標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交。微孔板雜交與膜印跡雜交相比，有如下優(yōu)點(diǎn)： 前者易操作；固相微孔板漂洗時(shí)間短，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，因?yàn)?膜雜交過程中，反應(yīng)劑要浸透膜中，漂洗時(shí)，使反應(yīng)劑全部浸出需 要時(shí)間較長；本底低，微孔板雜交不需Dehatdt液和預(yù)雜交以及封 閉過程。另外，微孔板固定的DNA不需再加熱或UV照射。微孔板雜交的基本過程包括L：DNA的固定，探針的雜交和酶聯(lián)顯色。DNA的固定在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可固定在微孔板上。不同來源

3、 的微孔板固定DNA時(shí)所需鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）來固定加熱變性的核酸，然后，用固 定濃度的標(biāo)記探針雜交。顯色后，判斷合適的固定鹽濃度。固定方 法的選擇必須使DNA最大量的固定，且不影響雜交。用合適濃度的 NaCl或(NH4)2SO4可達(dá)到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。鹽濃度合 適時(shí)，DNA應(yīng)為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使 DNA“平躺”固定在孔內(nèi)而影響雜交。Mg2+雖有促進(jìn)DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA應(yīng)大于300bp， 否則影響雜交結(jié)果。每孔可固定高達(dá)200ng(62

4、4bp)的DNA。合適的鹽 濃和固定量一經(jīng)確定，可按下法固定DNA。待固定DNA100加熱5min變性并立即冷卻。與合適的固定液混合后，加入微孔板的孔內(nèi)。固定液：10mmol/L磷 酸鈉-10mmol/LEDTA，pH7.0，合適濃度的NaCl（與DNA變性混合后， 終濃度為最適固定濃度）。用膠布封好，浸于37水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用于雜交，或封閉于塑料袋內(nèi)保存。雜交可采用標(biāo)準(zhǔn)的雜交系統(tǒng)雜交。夾心雜交時(shí)，是將變性的PCR產(chǎn)物與檢 測(cè)探針一并加。雜交與漂洗時(shí)間均較一般膜雜交短。顯色根據(jù)不同酶標(biāo)檢測(cè)分子的不同選擇不同的底物、終止劑和測(cè)定波 長。顏色互補(bǔ)分析法(A

5、)顏色互補(bǔ)分析法是利用三原色原理，當(dāng)不同DNA片段（A和B）同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，用引 物5端修飾技術(shù)將不同引物用不同顏色熒光素標(biāo)記（A片段引物標(biāo)記綠色的熒 光素，B標(biāo)記紅色的羅丹明）。如果僅有一條片段被擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物激發(fā)后，只有 一種顏色（紅色或綠色）。如果兩條不同大小的片段均被擴(kuò)增，可通過電泳分離，紫 外激發(fā)后可觀察到不同顏色的兩條帶。如果兩條被擴(kuò)增片段大小相同，電泳后可見一 條紅綠互補(bǔ)色-黃色帶。如果不用電泳法分離擴(kuò)增片段，通過一定手段除未摻入引 物，亦可觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色。此時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物無論大小，只要均被擴(kuò)增，就可見 一條紅綠互補(bǔ)的黃色條帶。該法簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化，可用于檢測(cè)基因，缺失、染色體轉(zhuǎn)

6、位和病原微生物。這種情 況下，只需判斷產(chǎn)物的有無。另外，在檢測(cè)多種基因?qū)嵶?、多種病原菌和HLA分型 時(shí)，可用復(fù)合PCR。此時(shí)，不同引物可用不同熒光素標(biāo)記（如綠色的ROX；藍(lán)色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測(cè)。因?yàn)?端修飾后仍 可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個(gè)引物的5端使其攜帶 便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團(tuán)，而通過另一引物5端的修飾使產(chǎn)物便于檢測(cè)。鏈霉親和素的包被：不同廠家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差異并不顯著。親和層析純化的鏈霉親和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmo

7、l/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1g/ml。向微孔板的每孔內(nèi)加入100l，封好，室溫過夜。 用PBS液漂洗。 擴(kuò)增產(chǎn)物與包被板的結(jié)合：PCR產(chǎn)物1l用501PBS-Tween液稀釋后加入包被孔內(nèi)。室溫下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未摻入的熒光引物。ELISA：向結(jié)合有PCR產(chǎn)物的孔內(nèi)加入50lPBS-Tween液稀釋的HRP-抗FITC抗體，室溫下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。 將1mgTMB溶于1ml二甲基亞砜中，用50

8、mmol/L醋酸鈉-檸檬酸液（Ph4.9）稀釋10倍， 向每孔內(nèi)加入30%（v/v）H2O23l，再加入80lTMB液，使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行25min ，再加入80l2mol/L硫酸終止反應(yīng)。于ELISA計(jì)數(shù)儀上450nm測(cè)定OD值。另外，引物的修飾除用圖2-3所示的生物素和FITC外，還可用DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合位 點(diǎn)和生物素修飾，將DNA結(jié)合蛋白質(zhì)（GCN5或TyrR）包被在微孔板內(nèi)，與PCR產(chǎn)物結(jié)合 后，可加入酶標(biāo)親和素進(jìn)行ELISA檢測(cè)。PCR-ELISA法可用于PCR產(chǎn)物定量分析。需注 意的是，定量分析時(shí)，PCR要在對(duì)數(shù)期內(nèi)終止，并需設(shè)立已知標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。 PCR-OLA法(A)研究表明、

9、不同個(gè)體中同源DNA片段序列間的差異大部分是限定于單個(gè)核苷酸的位 置。已弄清的人遺傳病的40個(gè)基因結(jié)構(gòu)變異中，絕大部分屬堿基替換，同樣，作為遺 傳連鎖分析標(biāo)記的大部分序列變異主要是位于基因組的非編碼區(qū)的點(diǎn)突變。所以，一 般基因檢測(cè)技術(shù)的一個(gè)重要要求是能很容易地檢出單一核苷酸變異。寡核苷酸連接試 驗(yàn)（OLA）就是為此目的而設(shè)計(jì)的。它可以單獨(dú)或結(jié)合PCR快速確定緊密相關(guān)的DNA序 列。OLA是通過設(shè)計(jì)兩種能與靶序列DNA精確并列雜交的寡核苷酸完成的。寡核酸雜交 后，DNA連接酶可使其正常配對(duì)的相鄰堿基共價(jià)連接，而錯(cuò)配的相鄰堿基可通過調(diào)節(jié) 連接酶和NaCl濃度防止其連接，連接產(chǎn)物可通過凝膠電泳觀察其

10、大小，或通過5端 修飾技術(shù)使一個(gè)寡核苷酸5端帶有一個(gè)配基。連接后，通過固相化的親和配基使其 固定，漂洗后，檢測(cè)另一寡核苷酸3端攜帶的適當(dāng)標(biāo)記分子。這一過程如重復(fù)進(jìn)行 多個(gè)循環(huán)，則連接產(chǎn)物會(huì)呈線性增加，故稱這循環(huán)進(jìn)行的OLA為連接檢測(cè)反應(yīng)（LDR）。 此反應(yīng)中若再加入兩種與上述寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸進(jìn)行循環(huán)的連 接反應(yīng)，則稱之為連接酶鏈反應(yīng)。兩寡核苷酸在無靶序列的情況下，在非常接近的位 置發(fā)生雜交的可能性極小，因此，OLA技術(shù)的假陽性極少。另外，連接酶所形成的鍵 是連接產(chǎn)物。該法適于簡(jiǎn)單、標(biāo)準(zhǔn)化的基因組樣品處理法，或直接用表面活性劑和蛋 白酶初步處理有核細(xì)胞作為檢測(cè)樣品。需指出的是

11、，這里是以放射性標(biāo)記檢測(cè)分子為 例的。如圖2-6中的地高辛標(biāo)記分子可避免放射性同位素的缺點(diǎn)，且敏感性相當(dāng)，更 易于自動(dòng)化。寡核苷酸的設(shè)計(jì)與標(biāo)記：用于OLA的寡核苷酸一般為20mer，使被檢變異核苷酸位于 即將連接的兩個(gè)寡核苷酸接頭的5端。即位于圖2-6中第2步左側(cè)寡核苷酸的3端。 左側(cè)寡核苷酸是5標(biāo)記生物素。右側(cè)寡核苷酸5端需磷酸化才能與左側(cè)寡核苷酸的 3-OH相連接。用PNK酶處理很易使其5或3標(biāo)記可以選擇其它標(biāo)記物（如熒光素 等）。OLA反應(yīng)：向一軟質(zhì)圓底微滴定板內(nèi)依次加入：3lPCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)物；1l剪切的鮭精DNA(10g /l);1l0.5mol/LNaCl混勻室溫作用10min。

12、加入1l0.5mol/LHCl，混勻。加入1l生物素標(biāo)記探針?biāo)芤海?40fmol）和1l32P探針（1.4fmol），2lT4連 接(約0.1WeiSS單位，用5連接緩沖液稀釋)。5X連接緩沖液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500g/lBSA。 不同寡核苷酸與底物反應(yīng)的連接所需酶液度不同，OLA試驗(yàn)時(shí)，一定要小心滴定最適 酶濃度，提高連接溫度（50）可擴(kuò)加OLA的特異性。混勻，在100%濕度下于37作用1h。加入1l1mol/LNaOH，混勻，室溫下作用10min

13、。加入1l1mol/LHCl中和。加入2l10%SDS，3l15%（w/v）鏈霉親和素包被的瓊脂糖懸液，混勻后室溫作用 10min。將一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100g/ml蛙精DNA煮過的Whatman4號(hào)濾膜置于點(diǎn)樣器 上，然后，將微孔板內(nèi)混合液加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，真空抽濾點(diǎn)膜。再用數(shù)毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分別依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鮮包好進(jìn)行放射自顯影。打點(diǎn)雜交當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時(shí)，用點(diǎn)雜交更合適。這種方法的基本過 程是，首先將擴(kuò)增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再 用放射性或非放射性標(biāo)記的探針雜交。點(diǎn)雜交還有助于檢測(cè)突變 DNA的突變類型，用于人類

14、遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同 位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)的敏感性、特異性和方法的可靠性 均不容懷疑，對(duì)人們認(rèn)識(shí)某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作 用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或 法醫(yī)檢驗(yàn)。因而用非放射性物質(zhì)（生物素、和地高辛等）標(biāo)記的寡 核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡(jiǎn)便而安全的 方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高、使用方便、安全、檢測(cè)速度 快。因此，本節(jié)僅敘述非放射性標(biāo)記探針的點(diǎn)雜交與檢測(cè)情況。膜的制備：點(diǎn)雜交膜的制備有兩種方法，一是將擴(kuò)增產(chǎn)物直接固定于膜上，每 一個(gè)探針制備1張膜。然后，用不同的等位基因特異或某一微生物特 異探針在

15、嚴(yán)格條件下雜交來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的突變類型或鑒定病原 菌；另一種方法是將不同的探針固定到尼龍膜上，然后，用標(biāo)記的 PCR產(chǎn)物作探針去雜交。這樣，根據(jù)雜交點(diǎn)的位置即可判斷產(chǎn)物序列 變異的種類。顯然，前一方法較后一方法繁瑣，費(fèi)時(shí)，費(fèi)力；而后 一方法僅需一次雜交即可判斷結(jié)果。產(chǎn)物的固定：取1張帶正電荷的尼龍膜，按點(diǎn)樣器的 大小裁剪膜，并做好標(biāo)記。將膜浸入水中濕透至少 1min。變性PCR產(chǎn)物：此步可在圓底微孔板或微量離 心管內(nèi)操作。每點(diǎn)的變性方法為；520l(50100ng)PCR 產(chǎn)物與100l變性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混勻，室溫作用5min即可。小心將預(yù)濕的膜裝在

16、點(diǎn) 樣器上，注意膜與點(diǎn)樣器接觸表面不能有任何氣泡。 因氣泡會(huì)使點(diǎn)樣點(diǎn)呈環(huán)形或月牙形或樣品間彌散融 合。膜固定后，每孔內(nèi)加100l變性混合液，打開真空泵。抽干變性液后，每孔內(nèi)再加100lTE緩沖 液，真空抽濾“洗滌”樣品。取下膜，置于厚3mm濾 紙上漬干。重復(fù)制備用于其它基因探針的膜時(shí)，一定要認(rèn)真清洗點(diǎn)樣器，以免樣品間的交叉污染。漬干 的膜于80真空干烤1h或于254nmUV光源下以60120mJ/cm2 的強(qiáng)度下照射使DNA固定在膜上。此時(shí)，的膜可直接用 于雜交，也可以用濾紙包好存于塑料袋或干燥缸內(nèi)。探針的固定：因寡核苷酸的探針太短，在膜上固定較 困難，即使固定上，也會(huì)影響雜交。這就是需要將寡

17、 核苷酸探針用末端轉(zhuǎn)移酶加polydT尾后，UV線照射固 定。因?yàn)閁V可激活胸腺嘧啶，使其與尼龍膜上的氨基共價(jià)結(jié)合，使探針間接地牢固地固定在尼龍膜上。這 種加尾固定的探針不影響雜交。但這種雜交對(duì)固定探針的要求是，在同一條件下與PCR產(chǎn)物的雜交必須是特 異的。通過選擇探針的合適長度，G+C含量或通過改變 探針的固定可達(dá)到特異性的要求。這種固定的探針可 用于檢測(cè)人類基因的突變，也可用來檢測(cè)病原微生 物。(1)加尾反應(yīng)是用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）催化，它可將dT依次加在寡核苷酸的3端，在四種脫氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通過改變dT濃度和TdT量 可調(diào)節(jié)加尾長度，在下述反應(yīng)條件下，加尾長

18、度可達(dá) 400個(gè)dT。向一微量離心管中依次加入：寡核苷酸探 針，100200pmol;10TdT緩沖液(1mol/L二甲胂酸鉀; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10l;dTTP80110nmol；TdT，6080U；補(bǔ)水至100l。 混勻后，稍加離心，置37水浴6090min。加入 100l10mmol/LEDTA終止反應(yīng)。加尾長度可通過10%聚 丙烯酰胺凝膠電泳監(jiān)測(cè)。(2)點(diǎn)膜：加尾探針6pmol，用0.3mol/LNaOH室溫處理5min，然后，用2.5mol/LNH4Oac中和。加入等體 積6SSC(1SSC:0.15

19、mol/LNaCl，0.015mol/L檸檬酸三 鈉pH7.0)。將6SSC預(yù)濕的尼龍膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在點(diǎn)樣器上。點(diǎn)樣方法同上。(3)固定：小心取下膜，置于TE緩沖液飽和的46 濾紙上，DNA面朝上。將濾紙和膜一起置于254nmUV 燈下照射固定，poly(dT)400尾的探針在40mJ/cm2r的 劑下固定效果最好。輻射劑與給定光源對(duì)給定面積的 能量釋放率（輻照度）和輻照時(shí)間有關(guān)。一般對(duì)一個(gè) 固定光源而言，輻照劑量為：輻照劑量（J/cm2）=輻照度（w/m2）輻照時(shí)間(s)其中，J為輻照能量單位；w為輻照通量單位。輻照度 與照射角度有關(guān)，與入射角度的余弦（c

20、os）呈正 相關(guān)。固定后，在100ml6SSC-0.5%SDS液中于4255 漂洗30min左右。漂洗后可立即用于雜交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾干后室溫保存。探針的固定量與加尾長度均影響雜交結(jié)果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探針與等PCR產(chǎn)物（2.33fmol） 雜交，固定6pmol苷酸雜交時(shí)，有29.2%的PCR產(chǎn)物與 1.1%的寡核而固定的探針600fmol雜交時(shí)，僅有2.2%的產(chǎn) 物與0.8%。用不同加尾長度的等量產(chǎn)物6pmol固定寡核苷酸與（時(shí)，僅0.33%233fmol）雜交結(jié)果表明， poly(dT)300探針與產(chǎn)物雜交；而有1.3%的探針poly (dT)400時(shí)

21、，則與產(chǎn)物雜交。因此，固定的探針加最好 在400個(gè)以dT尾上，固定量也至少6pmol。雜交寡核苷酸探針的雜交：每一寡核苷酸探針均有自己的雜交溫度和漂 洗條件，主要取決于探針的Tm值。Tm值則受探針長度，G+C含量和雜 交液的鹽渡影響。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)來計(jì)算Tm 值。在1mol/L鹽濃時(shí)，雜交溫度可比預(yù)測(cè)的寡核苷酸Tm值低520。 提高雜交溫度和降低鹽濃度可提高雜交的嚴(yán)格性。漂洗液一般不含 鹽，漂洗溫度比雜交溫度低5。一旦確定了探針的雜交與漂洗條 件，可按下述方法進(jìn)行雜交。在（2SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol

22、/LEDTA，Ph7.4）液中預(yù)濕點(diǎn)樣膜。置 膜于塑料封口袋中，并加入適量雜交液（SSPE，5Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋內(nèi)不要有氣泡。置于水浴加熱搖 動(dòng)，在雜交溫度下預(yù)雜交5min。取出塑料袋，剪開一角。加入非 放射性標(biāo)記物（如生物素-補(bǔ)骨脂素）標(biāo)記的探針。每毫升雜交中加 入1pmol探針。封口后搖育2060min。雜交時(shí)間不能太長，否則會(huì) 引起探針與膜的不可逆結(jié)合。從袋中取出膜，室溫下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗12次。漂洗溫度下預(yù)熱的漂洗 液在合適溫度下洗10min。漂洗后的膜可用于顯色檢測(cè)。反向點(diǎn)雜交：反向點(diǎn)雜交即擴(kuò)增產(chǎn)

23、物作為相中的探針與固定到膜上 的寡核苷酸雜交。如前述，這種雜交最基本的要求就是在同一條件 下，所有固定探針均與擴(kuò)增產(chǎn)物特異雜較。為此，主要是認(rèn)真選擇 與設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，使各探針在同一條件下Tm值相近。在同一雜 交特異。一旦確定了合適的雜交和漂洗條件，即可按上述基本程度雜交。只是雜交探針（產(chǎn)物）在加入前應(yīng)加熱變性或用等體積的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA變性。雜交時(shí)間（24h）要長些。PCR 產(chǎn)物的標(biāo)記可以用標(biāo)記引物擴(kuò)增或在擴(kuò)增時(shí)摻入標(biāo)記物。雜交的檢測(cè)不同非放射性標(biāo)記物的檢測(cè)原則上基本相同。若為酶標(biāo)探針則可直接進(jìn)行顯色檢測(cè)。下面以生物素標(biāo)記物為例加以說明。酶標(biāo)親和素的結(jié)合 漂洗后的膜在緩沖液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中與一定濃度的HRP-標(biāo)記鏈霉親和素在室溫作用10min，并輕輕振 蕩。用緩沖液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室溫下漂 洗5min，并輕輕振蕩，將膜上非特異吸附的HRP-鏈霉親和素洗掉。 顯色不同酶標(biāo)親和素的顯色條件與底物均不同，下面以HR