大腸菌群檢測

1、曹雙：請綜合看看各種方法，比較一下，有些內容是一致的，有些是每種方法不同于其他方法的，注意比較。第一篇（藍色部分為說明和附錄，去掉這部分剩下的為連續(xù)文件）大腸桿菌檢驗方法SN0169-92出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法GB/T4789.61994食品衛(wèi)生微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗（這兩個檢驗方法另有完全的PDF文件，見文件夾）以SN標準方法為例，進行說明。樣品制備：以無菌操作取25g樣品，放入裝有225mL稀釋劑的滅菌均質杯內，于8000r/min均質12min,制成1:10樣品勻液（也可用滅菌乳缽研磨的方法代替）。稀釋樣品勻液根據(jù)對樣品污染情況的估計，用稀釋劑將樣品勻

2、液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液，如10*-2、10*-3、10*-4。從制備樣品勻液至稀釋完畢，全過程不得超過15min。附：這是一種9管MPN法測定方法，什么是MPN法（最近似法）？MPN4簡介發(fā)布日期：2010-05-13瀏覽次數(shù)：212TheMostProbableNumberMethodInthefollowingexample,asetof3tubesofanallpurposebrothmediumisinocuTheMostProbableNumberMethodInthefollowingexample,asetof3tubesofanallpurposebrothmediu

3、misinoculatedfromeachoftheten-folddilutions,witheachtubebeinginoculatedwithoneml.Afterincubation,thenumberoftubesshowinggrowthisrecorded.Asthesucceedingdilutionsweremade,theorganismsweredilutedtosuchanextentthatnonewereintheinoculaofsevenofthetubes(markednegative).Inordertoestimatethenumberoforganis

4、mspermlofthesamplewhichwouldcausethiskindofgrowthresponse,welocatethethreesetsoftubeswhichshowdilutionoftheorganisms"toextinction"-i.e.,thosetubeswhichwereinoculatedfromthe102,10-3and10-4dilutions.附錄1g檢樣中最近似值（MPN/（補充件）以0.1、0.01、0.001g各用3管。陽性管數(shù)II陽性管數(shù)I1MPN|1MPN0.10.010.001|0.10.010.001|0001&

5、lt;3|20019.100113|20111400216I20212000319I203126010I3121011501116.1|21112001219.2|212127013112|2133402016.2|220121021I9.3|221128022I121222I35023I16122314203019.4|230129031I131231I36032I161232I440331I19112331I5310101I3.6|301012310117.2|301139102I111302I64103I151303I9511017.3|310143111I111311175112I15

6、1312I120113I191313I160120I111320I93121|15|321|150122|20|322|210123|24|323|290130|16|330|240131|20|331|460132|24I332|1100133|29I333|>1100LST和EC初步篩選：對每個樣品，選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯，每管接種1mL。將接種管置于36±1C培養(yǎng)48±2h0觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產(chǎn)生，用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內產(chǎn)氣的LST肉湯管培

7、養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.5±0.5C水浴箱內，培養(yǎng)48±2h。附：LST肉湯、EC肉湯有些什么？LST肉湯和EC肉湯中有什么？(發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣)一EC肉湯月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯氯化鈉5.0g3號膽鹽或混合膽鹽1.5g乳糖5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)2.75g磷酸氫二鉀(K2HPO4)4.0g磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.75g磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.5g月桂基硫酸氯化鈉5.0g鈉0.1g蒸儲胰蛋白(月示)或胰酪陳(Trypticase)20g胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g蒸儲水

8、1000.0mL1000.0mL將以上成分溶解于蒸儲水中，分裝將各成分溶解于蒸儲水中分裝到有倒立發(fā)酵管的16mrW150mm試管（管內有倒立的小發(fā)酵20mrW150mm試管中，每管10mL121c高壓滅菌15min。最終pH6.8±0.2。管），每管8mL121c高壓滅菌15min,最終H6.9+0.1EMB平板：取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍（EMB）平板,36±1C培養(yǎng)24±2ho檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。如有典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，

9、移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1C培養(yǎng)1824h。附：怎樣進行平板劃線分離？平板劃線分離的方法發(fā)布日期：2010-09-01瀏覽次數(shù)：2021.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法CufmPlaiAMeUnodiScml-quancllDllva4sMinllMrve品3日wwmpiMl曲曲nFoifl裾*1EHH1"平板劃線示例平板劃線示例發(fā)布日期：2010-09-01瀏覽次數(shù)：612平板戈U線示例Thisisanexampleofagoodstre平板劃線示例Thisisanexampleofagoodstrea

10、kforisolationusingthe"fourcorners"method.ThesmallcolonieshereareofStaphylococcusepidermidisThisisnotagreatstreakplatebutitisserviceable,asthereareafewisolatedcolonies.Thisplatewouldhavebeenbetteriftheloophadbeenflamedbetweeneachsector.ThisisanexampleofhowNOTtostreakforisolation.Scribblingi

11、snotstreaking,andmostlikelywillnotresultinisolatedcoloniesThisplateisolatestwodifferentcolonies:Escherichiacoli(thecream-colored)colonies,andSerratiamarcescens(theredcolonies).(粘質沙雷菌)ThisisaplatewithMicrococcusluteus滕黃微球菌，theyellowcolonies.Whilethisisagoodstreakforisolation,theplatehasbeencontaminat

12、ed.Thelarge"fuzzy"coloniesarefungalcolonies.Thelidmayhavebeenliftedtoofarawayfromtheplatewhilestreaking,oradraftmayhavecausedthesporestofallintotheplate.EMB平板原理及照片EMBF板照片及原理發(fā)布日期：2010-05-13瀏覽次數(shù)：238Thisimageillustratesthegrowthofgram-negativebacteriathatcannotfermentlactoseoneosinmethylenebl

13、ue(Thisimageillustratesthegrowthofgram-negativebacteriathatcannotfermentlactoseoneosinmethyleneblue(EMB)agar.EMBagarcontainsbilesaltsanddyeswhichinhibitgrowthofgram-positivebacteria.GrowthonEMBagarisausefuldiagnostictooltodistinguishbetweenlactosefermentersandnonfermenterswhichwillappearcolorless.Th

14、isimagecanbeusedtodescribetheuseofmetabolisminidentificationofbacteria.SalmonellaandShigella,bothnonlactosefermentingpathogens,canbedistinguishedfromthemorecommonintestinalflorawhichfermentlactose.Growthofdaclo&enan-fftrnienterASMMicrobeLibrafy.ckrgJohnsonlnfemb-an.jpgLactoseNonfermenteronEMBPat

15、Johnson,PalmBeachCommunityCollege,LakeWorth,Fla.,USA生化試驗：將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進行生化試驗。1色氨酸肉湯：在36±1C培養(yǎng)24±2h后，加Kovacs氏試齊1J0.20.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質陽性反應。附：靛基質試驗原理及照片靛基質試驗原理及照片發(fā)布日期：2010-05-13瀏覽次數(shù)：290靛基質（Indole）試驗：某些細菌能分解蛋白陳中的色氨酸，生成口引噪。口引噪的存在可用顯色反應表現(xiàn)出來。口引噪與對二甲基氨基靛基質（Indole）試驗：某些細菌能分解蛋白月東中的色氨酸，生成口引喋?？谝┑拇嬖诳捎?/p>

16、顯色反應表現(xiàn)出來?？谝┡c對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰口引喋，為紅色化合物。試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)24h時后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑23滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醛或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。實驗證明靛基質試劑可與17種不的靛基質化合物作用而產(chǎn)生陽性反應，若先用二甲苯或乙醛等進行提取，再加試劑，則只有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結果更為可靠?？诎?Ht”Eliaainle|Hilrveladfl

17、leASMMErobuUbiiry.ang&JohnsonMargaret(Peg)Johnson,MesaCommunityCollege,Mesa,Ariz.,USAThisimagedepictstheresultsofnegativeandpositiveindoletests.TheindoletestisfrequentlyemployedtodistinguishKlebsiellaorEnterobacterbacteria(indolenegative)fromEscherichiacoli(indolepositive).ThepresenceofE.coliisu

18、sedbypublichealthofficialsasanindicatoroffecalcontaminationoffoodandwatersupplies.Priortothistest,Enterobacteraerogeneswasusedtoinoculateonetryptonebroth,whileanothertryptonebrothwasinoculatedwithEscherichiacoli.Thetwobrothswerethenincubatedfor24handmixedwithKovasreagent(p-dimethylamino-benzaldehyde

19、).Tryptonebrothisrichintheaminoacidtryptophan.Tryptophanase,anenzyme,iscapableofcleavingtryptophanandproducingindole,pyruvicacid,andammonia.IndolecanbedetectedbythedevelopmentofaredcolorafteraddingKovasreagent.Organismsthatdonotproducetryptophanasewillbeindolenegative,asnoindolewillbepresenttoreactw

20、iththeKovasreagent2MR-VP培養(yǎng)基：在36土1C培養(yǎng)48±2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1mL至13m由100mm試管中，力口5%蔡酚乙醇溶液0.6mL,40%氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶，振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色，為VP試驗陽性。將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應。附：MR-VP試驗原理及照片MR-VFU驗原理及照片發(fā)布日期：2010-05-13瀏覽次數(shù)：224甲基紅(MethylRed)試驗腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖

21、代謝的途徑甲基紅(MethylRed)試驗腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。V-P試驗某些細菌在葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫竣成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白豚中的魔基生成紅色化合物，稱VP(+)反應。大腸桿菌：MR+/VP-3Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36土1c培養(yǎng)96h記錄有無生長。附：枸椽酸鹽利用試驗原理及斜面顯色照片枸椽酸鹽試驗原理及斜面照片發(fā)布日期：

22、2010-05-13瀏覽次數(shù)：136枸椽酸鹽試驗：某些細菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸錢作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應后成堿性，由于枸椽酸鹽試驗：某些細菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸錢作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。說明：SN標準所用培養(yǎng)基是肉湯培養(yǎng)基，且不加指示劑，因此，只能觀察是否渾濁生長。Koser氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫鏤鈉（NaNH4HPO44H2O）1.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.0g硫酸鎂（MgSO47H2O）0.2g枸椽酸鈉（含2H2O）3.0g蒸儲水1000.0mL將各成分溶解于蒸儲水中，分裝試管

23、，每管10mL,121c高壓滅菌15min。最終pH6.7±0.2。4LST肉湯：于36tC培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。5革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：靛基質1IMR11VP|枸椽酸鹽|鑒定（型別）1II1111十1+典型大腸桿菌一1+111非典型大腸桿菌111II1111十1+I-|+|典型中間型一11+11|十|非典型中間型1II1111-I-I+I+I典型產(chǎn)氣腸桿菌+II+I+I非典型產(chǎn)氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試驗。結果報

24、告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽抱桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗為十十或十，再根據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表，報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。第二篇大腸菌群測定的操作細則（MPN法）大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以100mL（g）檢樣內大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。1設備和材料1.1 溫箱：36±1Co1.2 冰箱:04C。1.3 恒溫水浴:44.585C。1.4 天平。1.5 顯微鏡。1.6 均質器或乳

25、缽。1.7 平皿:直徑為90mm。1.8 試管。1.9 吸管。1.10 廣口瓶或三角燒瓶：容量為500mL。1.11 玻璃珠：直徑約5mm。1.12 載玻片。1.13 酒精燈。1.14 試管架。2培養(yǎng)基和試劑1.1 乳糖膽鹽發(fā)酵管：按GB4789.28中4.9規(guī)定。1.2 伊紅美藍瓊脂平板：按GB4789.28中4.25規(guī)定。1.3 乳糖發(fā)酵管：按GB4789.28中4.10規(guī)定。1.4 EC肉湯：按GB4789.28中4.11規(guī)定。1.5 磷酸鹽緩沖稀釋液：按GB4789.28中3.22規(guī)定。1.6 生理鹽水。1.7 革蘭氏染色液：按GB4789.28中2.2規(guī)定。3操作步驟5.1 檢樣稀釋

26、5.1.1 以無菌操作將檢樣25mL（或g）放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內予置適當數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器，以8000-10000r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。5.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。5.1.3 另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。5.1.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或對檢樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，

27、每個稀釋度，接種3管。5.2 乳糖發(fā)酵試驗將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酉?管內，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1C溫箱內，培養(yǎng)24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。5.3 分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1C溫箱內，培養(yǎng)18-24h,然后取出,觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實試驗。5.4 證實試驗在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1C

28、溫箱內培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。5.5 報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100mL（g）大腸菌群的MPN值。4糞大腸菌群（faecalcoliform）5.1.0 用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物（見3.2條）轉種于EC肉湯管內，置44.5M.2C水浴箱內（水浴箱內的水面應高于EC肉湯液面，培養(yǎng)24±2h,經(jīng)培養(yǎng)后，如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報告為陰性；如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，置培養(yǎng)18-24h,凡平板上有典型菌落者，則證實為

29、糞大腸菌群陽性。4.2結果報告根據(jù)證實為糞大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN僉索表，報告每100mL（g）糞大腸菌群的MPNfi。第三篇由口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexportSN016992代替ZBX09002-861主題內容與適用范圍本標準規(guī)定了出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢驗方法。本標準適用于出口食品的檢驗。2設備和材料2.1吸管：1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。2水浴箱：44.585C。培養(yǎng)箱

30、：36±C,44.50.5C。冰箱：05c和-15-20C。均質器。乳缽和研棒。平皿：直徑90mm。天平：感量0.1g。顯微鏡。稀釋并氏:100mL、200mL和500mL三角燒瓶及廣口瓶。玻璃珠：直徑約5mm。菌落計數(shù)器。3培養(yǎng)基及試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白(LST)肉湯?；途G乳糖膽鹽(BGLB)肉湯。EC肉湯。伊紅美藍瓊脂(EMB)。營養(yǎng)瓊脂斜面。色氨酸肉湯。MR-VP培養(yǎng)基。Korser氏枸椽酸鹽肉湯。結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)。Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液。生理鹽水。革蘭氏染色液。Kovacs氏靛基質試劑。甲基紅指示劑。Vogesproskauer(VP)試劑。

31、4樣品制備以無菌操作取有代表性的樣品。如有包裝則用75%乙醇在開口處擦拭后取樣。若不能及時檢驗，應將冷凍樣品置于-15C保存；非冷凍而易腐的食品，應置于4c冰箱保存。檢驗前冷凍樣品可于25c18h內解凍，或在45c以下15min內解凍。不同食品樣品勻液的制備液體食品以滅菌吸管取樣25mL放入裝有225mL稀釋劑的滅菌玻璃瓶(瓶內預置適當數(shù)量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s內振搖25次（或以機械振蕩器振搖）,制成1:10的樣品勻液。固體和半固體食品以無菌操作取25g樣品，放入裝有225mL稀釋劑的滅菌均質杯內，于8000r/min均質12min,制成1:10樣品勻液（也可用滅菌乳缽研磨的方法代

32、替）。稀釋樣品勻液根據(jù)對樣品污染情況的估計，用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液，如10-2、10-3、10-4.。從制備樣品勻液至稀釋完畢，全過程不得超過15min。5大腸菌群的測定大腸菌群MPN值的測定對每個樣品，選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯，每管接種1mL。將接種管置于36±C培養(yǎng)48=2ho觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產(chǎn)生，記錄在24h和48h內產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則進一步作證實試驗。大腸菌群的證實試驗將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm

33、的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。置BGLB肉湯管于36tC培養(yǎng)48i2h。記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。結果報告：按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表（見附錄B（補充件）報告每克（毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。6糞大腸菌群測定用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48i2h內產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內放入帶蓋44.585C水浴箱內，培養(yǎng)24i2h。水浴箱的水平面應高于肉湯培養(yǎng)基液面。應以已知為44.5C產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和44.5C不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性對照。記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試

34、驗陽性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陰性。結果報告：按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。7大腸桿菌測定將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h,取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍（EMB）平板，36±1C培養(yǎng)24+2ho檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。如有典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，36+C培養(yǎng)1824h。將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進行生化試驗。色氨酸肉湯：在36±C培養(yǎng)24i2h后，力口Kovacs氏試劑0.2

35、0.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質陽性反應。MRVP培養(yǎng)基；在36±1C培養(yǎng)48i2h。以無菌操作移取培養(yǎng)物1mL至13mm<l00mm試管中，力口5%a蔡酚乙醇溶液0.6mL,40%氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結晶，振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色，為VP試驗陽性。將MRVP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應。Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±C培養(yǎng)96h記錄有無生長。LST肉湯：于30+C培養(yǎng)48立h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

36、大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下:靛基質MR+-+-+-+-+-+VP枸椽酸鹽鑒定（型別）-典型大腸桿菌-非典型大腸桿菌+典型中間型+非典型中間型+典型產(chǎn)氣腸桿菌+非典型產(chǎn)氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應類型,表明培養(yǎng)物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試結果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽抱桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗為+-或-+-,再根據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表，報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。8大腸菌群固體培養(yǎng)基測定法8.1樣品制備同第4章。計數(shù)選取適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品液，每個稀釋度接種兩個滅菌平皿，每皿1mL。另取lmL稀釋劑加入一個滅菌平皿中，作空白對照

37、。將冷至45i05c的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）1015mL傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加34mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36HC培養(yǎng)1824h。選用有30150個菌落的平板，計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為0.5mm或更大。證實從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，移種于BGLB肉湯管內，36±C培養(yǎng)24h和48h,觀察產(chǎn)氣情況。將出現(xiàn)產(chǎn)氣的肉湯管判為大腸菌群陽性。對形成菌膜的陽性管，應進行革蘭氏染色，以便排除革蘭氏陽性桿菌。結果報告經(jīng)最后證實為陽性

38、（產(chǎn)氣，革蘭氏陰性桿菌）的試管百分比乘以于8.2.5條中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液lmL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100X6/10X104/g(mL)=6.0¥05/g(mL)附錄A培養(yǎng)基和試劑（補充件）A1月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯胰蛋白或胰酪月東（Trypticase）20g5.0g氯化鈉乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2P04）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸儲水1000.0mL將各成

39、分溶解于蒸儲水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的20m/150mm試管中，每管10mL。121c高壓滅菌15min。最終pH6.810.2。A2煌綠乳糖膽鹽（BGAB）肉湯蛋白月東10.0g乳糖10.0g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200.0mL0.1%煌綠水溶液13.3mL蒸儲水將蛋白月東乳糖溶于約500mL蒸儲水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸儲水中，pH7.07.5）,用蒸儲水稀釋到975mL,調pH7.4。再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL,用蒸儲水補足到1000mL,用棉花過濾后，分裝到20mmel50mm試管（管內有倒立的小發(fā)酵管）中，每管1

40、0mL。121c高壓滅菌15min。最終pH7.2i0.1。A3EC肉湯胰蛋白或胰酪20.0g3號膽鹽或混合月1鹽1.5g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（KH2P04）4.0g磷酸二氫鉀（KH2P04）1.5g氯化鈉5.0g蒸儲水1000.0mL將以上成分溶解于蒸儲水中，分裝16mme150mm試管（管內有倒立的小發(fā)酵管），每管8mL。121c高壓滅菌15min,最終pH6.9W。1。A4伊紅美藍瓊脂（EMB）蛋白月東10.0g乳糖10.0g磷酸氫二鉀（KH2P04）2.0g瓊脂15.0g伊紅丫水溶性）0.4g或2%水溶液20mL美藍0.065g或0.5%水溶液13mL蒸儲水1000.0mL在1000

41、mL蒸儲水中煮沸溶解蛋白月東、磷酸鹽和瓊脂，加水補足至原量。分裝于三角燒瓶中。每瓶100mL或200mL,高壓滅菌15min。最終pH7.1±0.2。使用前將瓊脂融化，于每100mL瓊脂中加5mL滅菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊紅丫水溶液和1.3mL0.5%的美藍水溶液，搖勻，冷至4550c傾注平皿。A5營養(yǎng)瓊脂斜面牛肉膏3.0g蛋白陳5.0g瓊脂15.0g蒸儲水1000.0mL將各成分加于蒸儲水中，煮沸溶解。分裝合適的試管。121c高壓滅菌15min。最終pH7.3±0.1。滅菌后擺成斜面?zhèn)溆?。A6色氨酸肉湯胰月東或胰酪月東10.0g蒸儲水1000.0mL加熱攪拌溶

42、解胰月東或胰酪月東于蒸儲水中。分裝試管，每管5mLo121c高壓滅菌15min。最終pH6.910.2oA7MR-VP培養(yǎng)基月東7.0g葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）5.0g蒸儲水1000.0mL將各成分溶于蒸儲水中，分裝試管，121c高壓滅菌15min,最終pH6.9±0.2。A8Koser氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫鏤鈉（NaNH4HPO4?4H2O）1.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.0g硫酸鎂（MgSO4?7H2O）0.2g枸椽酸鈉（含2H2O）3.0g蒸儲水1000.0mL將各成分溶解于蒸儲水中，分裝試管，每管10mL,121c高壓滅菌15min。最終pH6.7±0.2。A9結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）蛋白臍7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或3號膽鹽1.5g中性0.03g結晶紫0.002g瓊脂1518g蒸儲水1000.0mL將上述成分溶于蒸儲水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調至pH7.4±0.1o煮沸2min,將培養(yǎng)基冷4550c傾注平板。臨用時制備，不得超過3h。A1OButterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液貯存液磷酸二氫鉀（K2HPO4）34