第二章DNA與染色體的結(jié)構(gòu)

1、第二章 DNA與染色體的結(jié)構(gòu) 從高等動(dòng)植物到簡(jiǎn)單的病毒都含有核酸，核酸（Nucleic acid）是生物體的基本組成物質(zhì)，是遺傳信息的攜帶者，它在生物的個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳和變異等生命過(guò)程中起著極為重要的作用。1953年，由Watson和Crick提出的DNA雙螺旋模型為人類進(jìn)一步深入了解生命現(xiàn)象，從分子水平揭開(kāi)遺傳的奧秘開(kāi)辟了一個(gè)嶄新的視野，為現(xiàn)代的分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和生物工程奠定了基礎(chǔ)。70年代以后，由于核酸限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA體外重組技術(shù)的興起，核酸序列分析方法的突破以及核酸人工合成的成功，極大地推動(dòng)了核酸的研究工作。人們可以按照自己的意愿創(chuàng)造出自然界不曾有的動(dòng)植物新品種

2、。隨著基因工程技術(shù)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，它將會(huì)為人類創(chuàng)造出更大的財(cái)富。本章主要介紹DNA和染色體的結(jié)構(gòu)。第一節(jié)第一節(jié) DNADNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性與動(dòng)態(tài)性結(jié)構(gòu)的多態(tài)性與動(dòng)態(tài)性 像研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)一樣，核酸的結(jié)構(gòu)有一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)之分。核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指多核苷酸鏈中核苷酸的排列順序。二級(jí)結(jié)構(gòu)是指在核酸中由部分或所有核苷酸殘基所形成的任何有規(guī)律的穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)則是指具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸所形成的更復(fù)雜的折疊狀態(tài)。 一一 、DNADNA一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu) 四種脫氧單核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）是DNA的基本組成單位，它們按照一定的方式、數(shù)量和排列順序而形成

3、的多核苷酸鏈即為DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)。具體來(lái)說(shuō)就是一個(gè)脫氧核苷酸的C3羥基與另一脫氧核苷酸的C5磷酸基以3, 5-磷酸二酯鍵相連，形成戊糖-磷酸骨架，堿基在內(nèi)側(cè)。這樣，核酸大分子或多核苷酸鏈有兩個(gè)末端，一末端有一個(gè)5位的 磷酸基叫5端，另一末端則為未結(jié)合的3-OH基叫3端（圖2-1A）。 在書(shū)寫時(shí)習(xí)慣上把5端放在左邊， 3端放在右邊，即按53方向書(shū)寫。多用縮寫式如 5pACGT3或pACGT、dACGT或5dACGT3、ACGT或5pACGT3表示脫氧多核苷酸的結(jié)構(gòu)。多核苷酸鏈的幾種表示方法，如右所示（圖2-1B、C）。 在真核生物DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)中，常見(jiàn)到一些重復(fù)序列（repetitive seq

4、uence）。按其復(fù)性快慢分為三類。（1）高度重復(fù)序列。重復(fù)頻率高，次數(shù)從幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)次。重復(fù)序列較短5300bp，多數(shù)為515bp。其中有些是反向 重 復(fù) 序 列 ， 也 稱 回 文 結(jié) 構(gòu)（palindrome），即該片段的堿基順序在互補(bǔ)鏈之間正讀反讀都相同。還有一些反向重復(fù)序列，中間被一些不相關(guān)的序列隔開(kāi)。反向重復(fù)序列都能形成十字架（交叉）和發(fā)卡結(jié)構(gòu)（圖2-2）。在高度重復(fù)序列中，還有一種簡(jiǎn)單的重復(fù)單位組成的重復(fù)序列。這類重復(fù)序列的重復(fù)單位一般由210bp組成，成串排列。這種重復(fù)序列的堿基組成與其他部分不同，富含AT，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開(kāi)，因此把它叫做衛(wèi)星DNA（s

5、atellite DNA）。又根據(jù)重復(fù)頻率和重復(fù)序列長(zhǎng)度不同，可分為小衛(wèi)星DNA（minisatelletite DNA）和微衛(wèi)星DNA（microsatelletite DNA）。相近種屬的高度重復(fù)序列存在相似性，不同種屬具有種屬特異性。高度重復(fù)序列可能參與DNA復(fù)制及基因表達(dá)的調(diào)控，小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA常作為一種分子遺傳標(biāo)記。（2）中度重復(fù)序列。重復(fù)頻率和重復(fù)序列長(zhǎng)度有很大差異，平均長(zhǎng)度 6105bp ，平均重復(fù)350次。有些成串地排列在DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的一個(gè)大的區(qū)域，有些則與單拷貝序列間隔排列；有些是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，有些序列不編碼蛋白質(zhì)。中度重復(fù)序列一般有種的特異性，可以作為探

6、針，區(qū)分不同種間細(xì)胞DNA。 （3）低度重復(fù)序列。又稱單拷貝序列，即序列不重復(fù)或只重復(fù)幾次、十幾次。重復(fù)序列長(zhǎng)度大于1000bp。此類序列攜帶大量能編碼各種功能不同蛋白質(zhì)的遺傳信息，也有一些是基因間隔序列。DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)際上就是DNA分子內(nèi)堿基的排列順序。這些高度有序的堿基序列蘊(yùn)藏了豐富的遺傳信息。任何一種DNA序列都可以反映出它的高度個(gè)體性或種族特異性。一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這些高級(jí)結(jié)構(gòu)又決定和影響著一級(jí)結(jié)構(gòu)的信息功能，即基因啟動(dòng)和關(guān)閉。因此，研究DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)闡明遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能以及它的表達(dá)、調(diào)控都是非常重要的。二、二、DNADNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年Wats

7、on和Crick在Chargaff規(guī)則和DNA X-射線衍射結(jié)果的基礎(chǔ)上提出了著名的DNA雙螺旋（double helix）結(jié)構(gòu)模型，即B-DNA模型（圖2-3）。模型的結(jié)構(gòu)特征如下：（1）兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸盤繞成右手雙螺旋。（2）糖與磷酸在外側(cè)形成螺旋的軌跡，彼此通過(guò)3,5- 磷酸二酯鍵相連。 （3）堿基伸向內(nèi)部，其平面與螺旋軸垂直。（4）兩條核酸鏈依靠彼此堿基之間形成的氫鍵相連系而結(jié)合在一起，且總是A與T，G與C配對(duì)。（5）雙螺旋的平均直徑為2 nm ，每個(gè)螺旋圈上升10對(duì)核苷酸，螺距為3.4 nm 。（6）沿螺旋中心軸方向看去，雙螺旋結(jié)構(gòu)上有兩個(gè)凹槽，一個(gè)較寬深，稱大

8、溝（major groove），另一個(gè)較淺小，稱小溝（minor groove）。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)一般情況下比較穩(wěn)定，維持其穩(wěn)定的作用力主要有：兩條多核苷酸鏈間的互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵作用。螺旋中堿基對(duì)疏水的芳香環(huán)堆積所產(chǎn)生的疏水作用力和上下相鄰的芳香環(huán)的電子的相互作用即堿基堆積力。這是一種最主要的作用力。磷酸基團(tuán)的氧原子帶負(fù)電荷，與細(xì)胞中的堿性組蛋白、亞精胺以及Mg2+等陽(yáng)離子化合物結(jié)合所形成的離子鍵，從而抵消負(fù)電荷之間的排斥作用。DNA是遺傳信息的載體，它的核苷酸序列不僅編碼各種蛋白質(zhì)，而且也與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)，這主要是通過(guò)其與一些蛋白質(zhì)因子間的相互識(shí)別和結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。目前認(rèn)為發(fā)生這一過(guò)程

9、的部位主要是大溝，它較之小溝能夠攜帶更多的形成氫鍵的信息（圖2-4）。圖中的圓圈代表螺旋的截面，大于180的一側(cè)表示大溝，另一側(cè)為小溝。在大溝中裸露的是堿基對(duì)頂部的基團(tuán)，這些基團(tuán)在不同的堿基對(duì)中排列的次序不同，也就制約了與之結(jié)合的蛋白質(zhì)因子結(jié)構(gòu)。這些基團(tuán)在4種堿基對(duì)的順序?yàn)椋捍鬁希篈-T 環(huán)氮，氨基，酮基 小溝：A-T 環(huán)氮， 酮基 T-A 酮基，氨基，環(huán)氮 T-A 酮基， 環(huán)氮 G-C 環(huán)氮，酮基，氨基 G-C 環(huán)氮，氨基，酮基 C-G 氨基，酮基，環(huán)氮 C-G 酮基，氨基，環(huán)氮可以看出，大溝中顯示的信息明顯多于小溝，則蛋白質(zhì)因子沿大溝所形成氫鍵的專一性更強(qiáng)。而小溝則相對(duì)信息少，專一性較弱。

10、當(dāng)然，這并不意味著小溝對(duì) DNA的功能并不重要。 三、三、DNADNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多態(tài)性二級(jí)結(jié)構(gòu)的多態(tài)性除B-DNA外，人們還發(fā)現(xiàn)到了其它的、結(jié)構(gòu)參數(shù)有一定差異的雙螺旋DNA，如A-DNA, Z-DNA等。這一現(xiàn)象稱為DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性（polymorphism）。產(chǎn)生的原因在于多核苷酸鏈的骨架含有許多可轉(zhuǎn)動(dòng)的單鏈，從而使糖環(huán)可采取不同的構(gòu)象。 （一）（一）A-DNAA-DNA當(dāng)DNA鈉鹽纖維在相對(duì)濕度為92%時(shí)，所處的狀態(tài)為B-DNA。當(dāng)DNA鈉鹽纖維相對(duì)濕度為75%時(shí)所處的狀態(tài)就叫A-DNA。A-DNA所形成的右手螺旋比B-DNA較大且較平，每旋轉(zhuǎn)一圈的螺距為2.8nm，每圈包含11個(gè)堿基對(duì)

11、，直徑為2.55nm，每對(duì)堿基轉(zhuǎn)角為33，堿基平面與軸夾角為20，這樣使A-DNA的大溝窄而極深，而小溝淺（圖2-5）。造成這些差異的原因是A-DNA中脫氧核糖殘基折疊方式為C3內(nèi)折，而B(niǎo)-DNA中則為 C2內(nèi)折（圖2-6）。 A-DNA雙螺旋不僅限于在A-DNA分子中存在，RNA的雙股發(fā)夾結(jié)構(gòu)及RNA-DNA雜交產(chǎn)物也有類似于A-DNA的雙螺旋。從不少實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷生物體內(nèi)某些DNA分子中可能存在A-DNA雙螺旋片段。 圖圖圖圖2-6 脫氧核糖的一些構(gòu)象脫氧核糖的一些構(gòu)象圖圖2-6 脫子氧核糖的一些構(gòu)象脫子氧核糖的一些構(gòu)象 （二）（二）Z-DNAZ-DNA1979年, Rich等通過(guò)對(duì)人工

12、合成的脫氧六核苷酸dCGCGCG的X射線晶體衍射分析，發(fā)現(xiàn)兩分子的上述片段以左手雙螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在于晶體中，其中碳與磷原子相連成鋸齒形（Zig-Zag），因此被命名為Z-DNA。其主要特征為：（1）以二聚體dGC或dCG為一個(gè)單位，并由6個(gè)這樣的單位構(gòu)成一個(gè)左手螺旋構(gòu)象，即每個(gè)螺旋包含12對(duì)堿基，螺距為4.5 nm，螺旋直徑為1.8nm，整個(gè)分子顯得細(xì)而長(zhǎng)。在Z-DNA中，嘧啶的糖苷鍵為反式構(gòu)象，而嘌呤的糖苷鍵則為順式構(gòu)象。（2）GC堿基對(duì)不是對(duì)稱地位于螺旋軸附近，而是移向邊緣伸展。從而使大溝外凸，小溝則變得窄而深（圖2-7）。 圖圖2-7 Z-DNA（三）三鏈（三）三鏈DNADNA在正常的

13、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上還可形成三股螺旋。依據(jù)三螺旋的形成機(jī)理和生物學(xué)意義，可分為三類：（1）分子間的三螺旋DNA。在一定條件下，合成的脫氧核苷酸插入DNA雙螺旋特定區(qū)域的大溝內(nèi)，通過(guò)氫鍵形成局部的分子間三螺旋結(jié)構(gòu)（圖2-8）。（2）分子內(nèi)的三螺旋DNA。 DNA 雙螺旋特定區(qū)，通過(guò)氫鍵作用，發(fā)生自身折疊，形成局部的分子內(nèi)三股螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)解離出一段DNA單鏈。（3）平行的三螺旋結(jié)構(gòu)。是指三螺旋結(jié)構(gòu)中的第三條鏈的序列與第一條鏈的序列相同，方向也相同，這種結(jié)構(gòu)的DNA又叫R-DNA（圖2-11），是因其與基因的重組（recombination）有關(guān)而得名。上述形成三螺旋的三條鏈一般均由Hpu或Hp

14、y組成。堿基配對(duì)方式是第三個(gè)堿基以A=T，G=C+ 配對(duì)，C必須質(zhì)子化(C+)，并且與G配對(duì)，只形成兩對(duì)氫鍵。 三螺旋中常見(jiàn)的堿基配對(duì)方式見(jiàn)圖2-12。 （四）四鏈（四）四鏈DNA DNA 染色體的端粒DNA上常有T4和G4重復(fù)序列。體外研究表明含有端粒重復(fù)序列的單鏈寡核苷酸可以形成四聯(lián)體螺旋結(jié)構(gòu)。由于該結(jié)構(gòu)由鳥(niǎo)嘌呤之間的氫鍵所維系，故又稱為G四聯(lián)體螺旋（G-quadruplex），其結(jié)構(gòu)的基本單元是G四聯(lián)體（G-quartet），它由四個(gè)鳥(niǎo)嘌呤在一正方形平面內(nèi)以氫鍵環(huán)形連接而成，因此，每一個(gè)G既為氫鍵的受體同時(shí)也為配體（圖2-13）。在四聯(lián)體的中心是由4個(gè)帶負(fù)電的羰基氧原子圍成的“口袋”，被

15、認(rèn)為是與陽(yáng)離子相互作用的位點(diǎn)。通過(guò)G四聯(lián)體的堆積，這類寡核苷酸可形成分子內(nèi)四聯(lián)體螺旋、雙分子間四聯(lián)體螺旋、四分子間四聯(lián)體螺旋結(jié)構(gòu)甚至更高級(jí)的結(jié)構(gòu)（圖2-14）。四鏈DNA的生物學(xué)功能可能在于參與端粒DNA的復(fù)制。四、四、DNADNA結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)性結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)性由上述討論可知，DNA分子存在有B、A、Z型、三鏈、四鏈DNA等二級(jí)結(jié)構(gòu)形式。隨著對(duì)DNA結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，人們逐步認(rèn)識(shí)到在天然DNA分子中，以B型結(jié)構(gòu)為主，但同時(shí)可能存在有其他類型的結(jié)構(gòu)形式，即DNA分子的基本結(jié)構(gòu)是B型，但在這個(gè)分子的某些區(qū)段會(huì)出現(xiàn)A、Z，甚至三鏈、四鏈，并且這些不同的結(jié)構(gòu)處于動(dòng)態(tài)變化中，也就是說(shuō)，條件不同，各不同結(jié)構(gòu)之

16、間還會(huì)相互轉(zhuǎn)變?cè)斐上鄳?yīng)的功能發(fā)生變化。這種不同 DNA結(jié)構(gòu)形式相互轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象稱為DNA結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)性.。 實(shí)驗(yàn)證明，水合的B-DNA在脫水時(shí)，或由于加入乙醇或鹽而使水的活度降低 時(shí)即轉(zhuǎn)變?yōu)锳型。這是由于B-DNA中，2-脫氧核糖的構(gòu)象發(fā)生了變化，使得同股核苷酸鏈中相鄰磷酸基間的距離縮短了0.1nm ，也使得每匝螺旋的堿基對(duì)數(shù)由10轉(zhuǎn)變?yōu)锳-DNA的11。A-DNA中堿基對(duì)也由B-DNA的集中于中心軸變化為向大溝方向移動(dòng)了約0.5nm，也就使A-DNA具有粗短，大溝更細(xì)更深的外形。另外還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，在DNA單股上合成RNA時(shí)，DNA與RNA所形成的雜交雙螺旋，可能是A型。在B-DNA向Z-D

17、NA轉(zhuǎn)變中，堿基平面相對(duì)于螺旋軸轉(zhuǎn)動(dòng)了180（圖2-15）。這一翻轉(zhuǎn)對(duì)交替d（GC）序列中的兩種殘基的構(gòu)象產(chǎn)生了不同影響，胞嘧啶核苷殘基整個(gè)轉(zhuǎn)動(dòng)了180，仍保持反式構(gòu)象，而鳥(niǎo)嘌呤核苷殘基中的堿基則繞苷鍵轉(zhuǎn)動(dòng)了180，結(jié)果導(dǎo)致多脫氧核苷酸主鏈的走向呈“Z”形（圖2-16）。研究表明，在大多數(shù)細(xì)胞的陽(yáng)離子條件下，交替的CG區(qū)段很可能處于B型，而在胞嘧啶被甲基化后，就轉(zhuǎn)向Z型。這樣甲基化所處環(huán)境就由B-DNA中的親水區(qū)轉(zhuǎn)而進(jìn)入Z型的疏水區(qū)，也就增加了穩(wěn)定性，進(jìn)而有利于DNA生物功能的發(fā)揮。DNA在發(fā)揮其生物功能過(guò)程 中，會(huì)呈現(xiàn)與其功能相適應(yīng)的各種特異性結(jié)構(gòu)，如三鏈，四鏈DNA等。但需要指出的是，無(wú)論

18、DNA結(jié)構(gòu)形式如何多樣，B-DNA仍然是DNA的最基本構(gòu)象。五、五、DNA結(jié)構(gòu)的呼吸作用結(jié)構(gòu)的呼吸作用雙鏈DNA中配對(duì)堿基的氫鍵不斷處于斷裂和再生狀態(tài)之中，特別是穩(wěn)定性較低的富含A-T的區(qū)段，氫鍵的斷裂和再生更為明顯。在微觀上，它們常常發(fā)生瞬間的單鏈泡狀結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象稱為雙螺旋的呼吸作用。這對(duì)于一些識(shí)別雙鏈DNA開(kāi)鏈成單鏈的蛋白質(zhì)結(jié)合到DNA上具有重要作用，這些蛋白質(zhì)需要處于呼吸狀態(tài)的雙鏈DNA來(lái)閱讀和識(shí)別DNA內(nèi)部所含信息（如堿基序列、堿基上可以作用的氫供體、氫受體的數(shù)目和方位等）。第二節(jié)第二節(jié) DNA的精細(xì)結(jié)構(gòu)的精細(xì)結(jié)構(gòu) 70年代末，人們對(duì)化學(xué)合成的具有確定序列的DNA片段晶體進(jìn)行射線衍射

19、發(fā)現(xiàn)，DNA雙螺旋實(shí)際上不是完全均勻的，它的許多結(jié)構(gòu)參數(shù)在一定范圍內(nèi)是隨堿基序列的不同而有所變化，這稱為DNA的局部構(gòu)象。如具GCGAATTCGCG的DNA片段的射線衍射分析指出，它的螺旋扭轉(zhuǎn)角 (helix twist angle)是在28-42（圖2-17）之間變動(dòng)而不是36。同樣，其它的參數(shù)如螺旋槳扭角（propeller twist angle），堿基轉(zhuǎn)動(dòng)角（roll angle of base pair）等也都會(huì)因堿基序列的不同而發(fā)生不同程度的變動(dòng)，堿基對(duì)之間也發(fā)生不同的滑動(dòng)，使得堿基堆積情況發(fā)生變化（圖2-18）。這種堿基序列的不同引起的堿基堆積的變化，是由于堿基對(duì)中，嘌呤的雙環(huán)結(jié)

20、構(gòu)大于嘧啶的單環(huán)結(jié)構(gòu)，在堿基配對(duì)中，嘌呤堿會(huì)超越中點(diǎn)占據(jù)嘧啶堿的一部分空間，這既增加了堿基的堆積程度，又使堿基功能團(tuán)間發(fā)生擠壓，而序列不同擠壓的情況不同。對(duì)嘌呤-（3-5）-嘧啶序列，來(lái)自鳥(niǎo)嘌呤6、腺嘌呤N6間的擠壓出現(xiàn)在大溝中；對(duì)于嘧啶-（3-5）-嘌呤序列，來(lái)自鳥(niǎo)嘌呤N3，N2 腺嘌呤N3間的擠壓在小溝中發(fā)生（圖2-19）?？梢?jiàn)小溝中的擠壓更為嚴(yán)重。 為減少不利的擠壓，使堿基堆積更加有利，雙螺旋結(jié)構(gòu)就要做出局部調(diào)整，如改變各個(gè)結(jié)構(gòu)參數(shù)等，甚至形成交叉氫鍵，這些變化就形成了DNA的精細(xì)結(jié)構(gòu)（fine structure）。而這些精細(xì)結(jié)構(gòu)正是相應(yīng)蛋白質(zhì)因子與靶位點(diǎn)進(jìn)行專一性識(shí)別和結(jié)合從而發(fā)揮D

21、NA功能的標(biāo)志。 另?yè)?jù)觀察，DNA與一些蛋白質(zhì)因子的結(jié)合部位是一些彎曲結(jié)構(gòu)，這些彎曲（blend）是由連續(xù)的A殘基產(chǎn)生的，每 組連續(xù)的A的數(shù)目一般為36個(gè)，并且要求連續(xù)的A之間需被其它核苷酸隔開(kāi)。 含G-T、A-C、G-A堿基對(duì)的寡聚核苷酸的晶體分析說(shuō)明，這些錯(cuò)配的堿基對(duì)都能包容在B-DNA中，它們的構(gòu)象參數(shù)一般處于允許范圍內(nèi)，如G-A的一種配對(duì)方式僅寬1.07nm ，與G-C對(duì)的尺寸十分接近，也不引起螺旋方向改變，因此，這一錯(cuò)配 對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)并不產(chǎn)生明顯的影響，但腺嘌呤官能團(tuán)所處位置與螺旋的其余部分 明顯不同，這一特點(diǎn)就為修復(fù)酶提供了識(shí)別標(biāo)志。 對(duì)錯(cuò)配的堿基包容于雙螺旋，以及它們所產(chǎn)生的構(gòu)

22、象變化與其所處序列環(huán)境（sequence environment）間的關(guān)系的深入研究，將有利于對(duì)復(fù)制過(guò)程的校對(duì)以及復(fù)制后的修復(fù)和重組酶系的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。 另外，Z-DNA的形成與特定的d（GC）序列有關(guān)，這也說(shuō)明DNA的局部構(gòu)象對(duì)特定序列的依賴性。 DNA的局部構(gòu)象與其功能有著密切的聯(lián)系。DNA所攜帶的遺傳信息，一類是編碼蛋白質(zhì)，它們通過(guò)核苷酸三聯(lián)體與各個(gè)氨基酸間的對(duì)應(yīng)關(guān)系使遺傳信息由DNA流向蛋白質(zhì)，但遺傳信息的這種流動(dòng)不是靠基因自身的功能，而是通過(guò)獨(dú)立于該基因之外的蛋白質(zhì)合成機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，蛋白質(zhì)基因的表達(dá)不總是構(gòu)成型的，它是受調(diào)控的。DNA所攜帶的第二類信息即是與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的信息，

23、它們就 貯存在DNA的精細(xì)結(jié)構(gòu)中，直接表現(xiàn)為特定的空間結(jié)構(gòu)，即密碼結(jié)構(gòu)域（code domain）,它能被相應(yīng)的蛋白質(zhì)因子識(shí)別并結(jié)合，從而控制蛋白質(zhì)基因的表達(dá)。 凡能結(jié)合于DNA的蛋白質(zhì)叫作DNA-結(jié)合蛋白（DNA-binding protein）。它包括各種酶（如DNA聚合酶、RNA聚合酶等）和調(diào)節(jié)蛋白（如CAP等）。這些蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合涉及到遺傳個(gè)體發(fā)育等生物學(xué)中的一些基本問(wèn)題。因此核酸蛋白質(zhì)的交互作用（nucleic acid-protein interaction）已成為分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是一個(gè)雙向過(guò)程，DNA的局部構(gòu)象既提供了識(shí)別標(biāo)志和發(fā)生交互作用的

24、結(jié)構(gòu)條件，而蛋白質(zhì)的結(jié)合又促使該處DNA的構(gòu)象發(fā)生進(jìn)一步的變化或使交互作用深化。第三節(jié)第三節(jié) DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)和的超螺旋結(jié)構(gòu)和拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶一、一、DNADNA的超螺旋結(jié)構(gòu)的超螺旋結(jié)構(gòu) DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的構(gòu)象，包括線形雙鏈中 的 紐 結(jié) （ k i n k e d ） 、 超 螺 旋（supercoiled,superhelix）、多重螺旋、分子內(nèi)局部單鏈環(huán)和環(huán)狀DNA中的超螺旋及連環(huán)等拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)中最常見(jiàn)的一種結(jié)構(gòu)。環(huán)狀DNA分子，線形雙螺旋分子兩端連接起來(lái)或因與蛋白質(zhì)結(jié)合而固定時(shí)，進(jìn)一步扭曲都可形成超螺旋。雙螺旋DNA處

25、于擰緊狀態(tài)時(shí)所形成的超螺旋稱作正超螺旋（左手超螺旋）（positive supercoil）(圖2-20)，處于擰松狀態(tài)則形成負(fù)超螺旋 （ 右 手 超 螺 旋 ） （ n e g a t i v e supercoil）。天然DNA分子都處于負(fù)超螺旋。DNA形成超螺旋結(jié)構(gòu)便進(jìn)入另一種熱力學(xué)上的穩(wěn)定狀態(tài)，但不會(huì)改變環(huán)形雙螺旋DNA分子中一股多核苷酸鏈與另一股多核苷酸鏈的交叉次數(shù)，DNA分子的這種變化可用一數(shù)學(xué)式來(lái)描述：L=T+W L稱為連接數(shù)（linking number）是指環(huán)形DNA分子的兩條鏈彼此盤繞的次數(shù)，它是環(huán)型雙螺旋DNA分子的拓?fù)湫再|(zhì)，只要不發(fā)生鏈的斷裂，它就是一個(gè)定值。右手螺旋時(shí)

26、規(guī)定為正值。T稱為盤繞數(shù)（twisting number），它代表DNA的一股鏈繞雙螺旋軸所做的完整旋轉(zhuǎn)數(shù)，數(shù)量上等于堿基對(duì)總數(shù)除以每一圈的堿基對(duì)數(shù)，即等于雙螺旋的總轉(zhuǎn)數(shù)。W為超盤繞數(shù)（writhing number），代表雙螺旋軸在空間的轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)。T和W是變量。因?yàn)樵谝粋€(gè)完整的環(huán)狀雙螺旋分子中L為常數(shù)，所以當(dāng)其形成超螺旋時(shí)，T和W數(shù)值相等，方向相反。例如：SV40DNA含5226核苷酸對(duì)，T= 5226/10.5=497 ，實(shí)際測(cè)得W= 26 ，則 L=T+W=497+(-26)=471。當(dāng)LT即擰松狀態(tài)，DNA形成負(fù)超螺旋。 DNA分子形成超螺旋的生物學(xué)意義在于，一是超螺旋DNA具有更緊密的

27、形狀，因此在DNA 組裝中具有重要作用。二是DNA的結(jié)構(gòu)具有動(dòng)態(tài)性，這有利于其功能的發(fā)揮，而DNA超螺旋程度的改變介導(dǎo)了這種結(jié)構(gòu)的變化。B-DNA是一種熱力學(xué)上的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，超螺旋的引入就提高了它的能量水平。負(fù)超螺旋的存在會(huì)影響DNA結(jié)構(gòu)變化的平衡，具超螺旋的DNA能實(shí)現(xiàn)松弛態(tài)DNA所不能實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。二、拓?fù)洚悩?gòu)酶二、拓?fù)洚悩?gòu)酶 細(xì)胞內(nèi)存在一類能催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體（topoisomer）相互轉(zhuǎn)化的酶，它們稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）。它們能與DNA形成共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)-DNA中間體，從而在其骨架的磷酸二酯鍵處造成暫時(shí)性的裂口，使DNA的多核苷酸鏈得以穿越，結(jié)果改變了分子的拓

28、撲狀態(tài)。在這一過(guò)程中，DNA的連接數(shù)雖然改變了，但其核苷酸序列并無(wú)任何變化。拓?fù)洚悩?gòu)酶共有兩類:型和型拓?fù)洚悩?gòu)酶。（一）（一）型拓?fù)洚悩?gòu)酶型拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：僅切斷雙鏈DNA的一條鏈，即催化瞬時(shí)的單鏈斷裂和連接，不需要能量輔助因子如ATP和NAD等，因而不能催化需能的超螺旋化結(jié)構(gòu)。 目前研究較為清楚的是大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶（過(guò)去叫做蛋白）。其作用機(jī)理是，當(dāng)酶與DNA結(jié)合時(shí)，可形成穩(wěn)定的 復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物是切斷DNA鏈的5-磷酸基與酶的酪氨酸羥基以酯鍵連接而成的，同時(shí)酶的另一端共價(jià)連接在3-OH基上。在此發(fā)生的是磷酸二酯鍵的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，由DNA轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)。當(dāng)DNA的一股鏈穿越切割點(diǎn)繞另一股旋轉(zhuǎn)

29、一圈后，原來(lái)斷裂的DNA重新連接，酶被釋放。即磷酸二酯鍵又由蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到DNA（圖2-21）。整個(gè)過(guò)程并不發(fā)生鍵的不可逆水解，沒(méi)有能量的丟失。因此不需要外界供給能量，結(jié)果由于L由n變?yōu)閚+1而增加了正超螺旋或減少了負(fù)超螺旋。 圖圖2-21 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)制的作用機(jī)制 （二）（二）型拓?fù)洚悩?gòu)酶型拓?fù)洚悩?gòu)酶型酶作用的共同特點(diǎn)是：同時(shí)切斷、縫合DNA的兩條鏈，不需要單鏈切口存在，因而每個(gè)反應(yīng)后改變兩個(gè)鏈環(huán)數(shù)；需要能量輔助因子。 大腸桿菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶又叫旋轉(zhuǎn)酶（gyrase），作用的可能機(jī)制如圖2-22所示。當(dāng)反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，DNA圍繞著酶卷起，然后將兩條鏈切斷，2個(gè)A亞基分別與5-磷酸基結(jié)

30、合，在酶構(gòu)象改變的牽引下， 另一雙鏈穿越酶蛋白提供的裂隙（切口），最后斷裂的2條鏈又重新連接。ATP水解產(chǎn)生的能量用來(lái)恢復(fù)酶的構(gòu)象，從而可進(jìn)行下一次循環(huán)。拓?fù)洚悩?gòu)酶功能是將復(fù)制叉前的正超螺旋轉(zhuǎn)為負(fù)超螺旋，從而釋放由復(fù)制叉移動(dòng)造成的張力。其每將一個(gè)正超螺旋轉(zhuǎn)為負(fù)超螺旋，就將DNA的連接數(shù)L的符號(hào)從+1變?yōu)?1，則L的變化為 L=-2。在細(xì)胞中，拓?fù)洚悩?gòu)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的量是相互抗衡，并受到精細(xì)地調(diào)節(jié)的，這能保證DNA的負(fù)超螺旋程度達(dá)到一個(gè)最佳狀態(tài)。圖圖2-22 E.coli DNA 旋轉(zhuǎn)酶導(dǎo)入負(fù)超螺旋的作用機(jī)理旋轉(zhuǎn)酶導(dǎo)入負(fù)超螺旋的作用機(jī)理第四節(jié) DNA的變性、復(fù)性與分子雜交 一、一、DNADNA的

31、變性的變性在物理和化學(xué)因素的影響下，維系核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA雙鏈解旋成單鏈，這一過(guò)程稱為核酸的變性（denaturation）。核酸的變性可發(fā)生在整個(gè)DNA分子中，也可發(fā)生在局部的雙螺旋節(jié)段上（局部變性），但無(wú)論哪一種情況，均不涉及核苷酸中二酯鍵的斷裂。引起變性的因素有酸、堿、尿素、胍等變性劑和乙醇、丙酮等化學(xué)因素以及熱、紫外線等物理因素。 變性后的DNA，由雙鏈變?yōu)閱捂?，原?lái)隱藏在雙螺旋內(nèi)部的發(fā)色基團(tuán)暴露出來(lái)，其一系列的物理、化學(xué)性質(zhì)都發(fā)生變化。其中最明顯、最有用的變化是在260nm處紫外吸收值增高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)（hyperchromic effect）（圖2

32、-23），另外還有粘度下降、沉降速度增加、浮力密度上升等現(xiàn)象。所以實(shí)驗(yàn)室常利用這些性質(zhì)來(lái)追蹤變性過(guò)程。 由加熱引起的變性叫熱變性。當(dāng)將DNA稀鹽溶液加熱到80左右，雙螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，氫鍵斷裂，兩條鏈彼此分開(kāi)形成無(wú)規(guī)則線團(tuán)，這種由雙螺旋轉(zhuǎn)變成線團(tuán)的過(guò)程稱螺旋-線團(tuán)轉(zhuǎn)移（helix-coil translation）（圖2-24）。加熱變性一般在較窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，象結(jié)晶物質(zhì)的熔點(diǎn)只在很狹窄的范圍內(nèi)發(fā)生一樣，如果以溫度對(duì)紫外吸收作圖，可得一S形曲線，稱為熔解曲線（melting cure ）（圖2-25）。熔解曲線的中點(diǎn)，即一半的DNA雙螺旋解為單鏈所對(duì)應(yīng)的溫度稱為熔解溫度或解鏈溫度（melt

33、ing temperature,transition temperature，Tm）。每一種DNA都有一個(gè)解鏈溫度，通常Tm值在85-95之間。事實(shí)上Tm值并不是一個(gè)固定常數(shù)，它受以下因素的影響： （1）DNA堿基組成。DNA的Tm 值主要與組成DNA分子中的堿基對(duì)組分有關(guān)，G-C含量越高，Tm值就越高;A-T含量越多，Tm值就越低（圖2-26）。這是因?yàn)镚-C對(duì)中三個(gè)氫鍵較A-T對(duì)中兩個(gè)氫鍵牢固的原因。在標(biāo)準(zhǔn)條件下即0.15mol/LNaCl-0.0015mol/L檸檬酸鈉溶液中,Tm值與堿基對(duì)組成之間的經(jīng)驗(yàn)公式是：Tm=69.3+0.41(G+C) （2）DNA的均一性。DNA分子序列組成

34、越均一，如多聚A-T或多聚G-C，其變性過(guò)程同步性越好,Tm范圍較窄，表現(xiàn)為一條很陡的熔解曲線；反之，非均一性 DNA分子，則Tm范圍較寬。（3）溶液的離子強(qiáng)度。DNA雙鏈骨架上磷酸基因帶有較多的負(fù)電荷，它們之間的靜電排斥作用是造成雙鏈不穩(wěn)定的因素之一。同一種 DNA分子在不同離子強(qiáng)度溶液中其Tm值不同（2-27）。在低離子強(qiáng)度中，Tm值較低，而且解鏈的溫度范圍較寬;在高離子強(qiáng)度溶液中，Tm值較高，解鏈溫度范圍較窄。這是由于溶液中離子與DNA分子中磷酸基團(tuán)形成離子鍵，即正離子可以封閉磷酸基團(tuán)的負(fù)電性使DNA比較穩(wěn)定，需更多能量才能使其變性，故Tm值亦升高。 （4）pH值。核酸溶液的pH在59范

35、圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。當(dāng)溶液pH小于4時(shí)，堿基A、G、C上的氮原子質(zhì)子化；當(dāng)pH值大于11時(shí)，堿基G和C上的氮原子去質(zhì)子化，這些均不利于氫鍵的形成。二、二、DNADNA的復(fù)性的復(fù)性變性的DNA重新恢復(fù)為雙螺旋的過(guò)程，叫做復(fù)性（renaturation）或退火。DNA復(fù)性時(shí)，其紫外線吸收值降低，這種現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)（hypochromic effect）。復(fù)性過(guò)程并不是變性反應(yīng)的簡(jiǎn)單逆過(guò)程，變性過(guò)程可以在一個(gè)很短時(shí)間內(nèi)完成，而復(fù)性則需要相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間才能完成。復(fù)性可分為兩個(gè)階段，首先是成核 （nucleation），其次是拉鏈（zippering）。復(fù)性開(kāi)始時(shí)，兩條DNA單鏈隨機(jī)碰撞形成局部雙鏈

36、，若在此時(shí)局部雙鏈周圍的堿基不能配對(duì)則會(huì)重新解離，繼續(xù)隨機(jī)碰撞，一旦找到了正確的互補(bǔ)區(qū)形成一定長(zhǎng)度的堿基對(duì)即成核。在此基礎(chǔ)上兩條單鏈的其余部分就像“拉鏈”那樣完成整個(gè)復(fù)性過(guò)程。一個(gè)穩(wěn)定的成核區(qū)有10-20個(gè)堿基對(duì)。 在一定條件下，復(fù)性速度的變化可用 Cot值來(lái)衡量。Co表示變性DNA的最初濃度(bp，mol/L)，t為復(fù)性時(shí)間（秒），即變性DNA的最初濃度與復(fù)性時(shí)間的乘積（mols/L）。DNA所含信息量越少?gòu)?fù)性越容易，Cot值越小。反之，亦然。即Cot值與復(fù)性速度成反比。例如，大腸桿菌的分子大小是T4DNA的30倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌DNA的Cot 是9mols/L，而T4的Cot 是0

37、.3mols/L，說(shuō)明大腸桿菌DNA分子結(jié)構(gòu)和信息含量要比T4DNA復(fù)雜得多；也說(shuō)明在相同條件下，大腸桿菌DNA 互補(bǔ)單鏈數(shù)量比T4DNA單鏈數(shù)量少得多，分子碰撞機(jī)會(huì)也少，故復(fù)性的速度也慢得多。影響復(fù)性速度的因素有下列幾種：（1）DNA的大小。DNA片段小的比大的容易復(fù)性。（2）離子強(qiáng)度。DNA溶液的離子強(qiáng)度對(duì)復(fù)性影響較大，這是因?yàn)辂}可以減少兩條互補(bǔ)鏈負(fù)電荷的排斥作用。通常增加鹽濃度，可加速兩條補(bǔ)鏈重新結(jié)合的速度。 （3）DNA濃度。DNA濃度越大，兩條互補(bǔ)鏈彼此相遇的可能性越大，復(fù)性速度也越快。DNA復(fù)性反應(yīng)的初始濃度Co與反應(yīng)完成一半所需時(shí)間的乘積用Cot1/2表示，它是個(gè)常數(shù) ， 亦 稱

38、 D N A 分 子 的 復(fù) 雜 度（ complexity,C）。圖2-28表示各種不同的DNA的復(fù)性動(dòng)力學(xué)曲線。從圖中可以看出，一種DNA分子的分子量越大，其完成復(fù)性所需的時(shí)間越長(zhǎng)，則Cot1/2越大。 三、酸的分子雜交三、酸的分子雜交相同或不同來(lái)源的二個(gè)DNA分子，或DNA和RNA分子混合在一起，如果含有彼此互補(bǔ)的序列，通過(guò)變性和復(fù)性處理，DNA-DNA同源序列間及DNA-RNA異源序列間都可形成雜交體，稱核酸的分子雜交（Nucleic acid hybridization）。 核酸分子雜交是目前分子生物學(xué)最廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。利用此技術(shù)，可以求出特定基因的頻率 、基因組織的特點(diǎn)、基因結(jié)

39、構(gòu)和定位、基因表達(dá)等。根據(jù)核酸分子雜交的原理，有目的地人工制備或從基因組中分離一段已知序列的DNA，使其帶上標(biāo)記，經(jīng)變性后成為單鏈，在一定條件下與待測(cè)DNA單鏈雜交，如兩者序列有同源性，就形成帶有標(biāo)記的雙鏈DNA分子，這也就等于檢測(cè)到了待測(cè)的DNA。這段帶有標(biāo)記的核苷酸序列稱為核酸探針（Nucleic acid probe）或基因探針（Gene probe）。核酸的分子雜交方法有多種，下面簡(jiǎn)要介紹常用的幾種。（一）（一）SouthernSouthern印跡雜交（印跡雜交（Southern Southern blotingbloting）這一技術(shù)是由E.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的

40、，因此將其命名為Southern 印跡雜交技術(shù)。具體步驟是將DNA樣品用一種或幾種限制性內(nèi)切酶消化后，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)堿變性等預(yù)處理，使其中的DNA雙鏈分子變性為單鏈，然后利用毛細(xì)管作用原理或其它物理方法，將凝膠中的單鏈DNA分子轉(zhuǎn)移并固定到固相支持物表面上（一般為硝酸纖維素膜或尼龍膜），此時(shí)的DNA片段還保留著原來(lái) 譜帶的模式。此時(shí)用核酸探針與膜上的DNA片段雜交，那么，與探針有同源性的DNA片段在膜上的位置便可通過(guò)放射自顯影被檢測(cè)出來(lái)（圖2-29）。此法靈敏度很高，可以檢測(cè)出僅含2ng的DNA電泳條帶。它幾乎可以同時(shí)用于構(gòu)建DNA分子的酶切圖譜和遺傳圖。圖圖2-29 South

41、ern分子雜交技術(shù)用于檢測(cè)特異分子雜交技術(shù)用于檢測(cè)特異DNA 序列的存在序列的存在 （二）（二）Northern Northern 印跡雜交（印跡雜交（Northern Northern blotingbloting）這種方法由于與Southern印跡雜交技術(shù)十分類似而得名。所不同的是：Northern印跡雜交是將RNA分子從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或其它化學(xué)修飾的活性濾紙上，從而進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。此法因測(cè)定的是細(xì)胞的總RNA或mRNA，所以操作時(shí)需注意：（1）RNA極易被環(huán)境中存在的RNA酶系所降解，因此在提取過(guò)程中應(yīng)謹(jǐn)防RNA酶的污染，（2）為保持RNA電泳時(shí)呈單鏈線形狀態(tài)，防止其

42、形成發(fā)夾式二級(jí)結(jié)構(gòu)，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)需在變性劑（乙二醛或甲醛、甲基氫氧化汞）的存在下進(jìn)行。（3）印跡前須將變性劑用水沖洗去掉。（三）斑點(diǎn)雜交（三）斑點(diǎn)雜交（dot blottingdot blotting）斑點(diǎn)雜交是在Southern 印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的快速檢測(cè)特異核酸（DNA或RNA）分子的雜交技術(shù)。操作是通過(guò)抽真空的方式將加在多孔過(guò)濾進(jìn)樣器上的核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上，然后按如同Southern或Northern 印跡雜交一樣的方式同核酸探針?lè)肿舆M(jìn)行雜交。因加樣時(shí)使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾多待測(cè)的核酸樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣，因此稱為斑

43、點(diǎn)印跡雜交。此法更適用于核酸樣品的定量檢測(cè)。而不是定性檢測(cè)?？赏ㄟ^(guò)掃描儀掃描斑點(diǎn)的放射性脈沖數(shù)，來(lái)確定樣品中RNA或DNA分子的相對(duì)含量。 （四）原位雜交（四）原位雜交（in situin situ hybridizationhybridization）組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，是在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細(xì)胞內(nèi)與RNA或DNA雜交，雜交反應(yīng)在載物片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。其基本步驟是通過(guò)適當(dāng)處理使細(xì)胞通透性增加，探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交、沖洗等。用放射自顯影或免疫酶法顯示雜交結(jié)果。用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈 DNA和RNA探針。所用的探針要短，才能盡量使探針摻入細(xì)胞內(nèi)。一

44、般用具50300bp長(zhǎng)度的探針較合適。新近研究表明，人工合成的1630bp的寡核苷酸短鏈能自由進(jìn)出組織細(xì)胞壁，雜交效率也高，是原位雜交的優(yōu)良探針。探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物和半抗原等。原位雜交可以用來(lái)確定探針的互補(bǔ)序列在細(xì)胞內(nèi)的空間位置，用標(biāo)記的探針與細(xì)胞分裂中期染色體DNA雜交以研究染色質(zhì)中特定核酸序列，與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞和組織中的分布和特定基因表達(dá)水平。原位雜交是一種發(fā)展極為迅速的新技術(shù)，但敏感性、特異性和穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步完善和提高。第五節(jié) DNA序列分析及進(jìn)展 遺傳信息儲(chǔ)存在DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列中，特定的序列表達(dá)的信息是什么？首要的任務(wù)是序列測(cè)定。人類基因組基本框架已經(jīng)建立，并期望盡快弄清全部基因組序列，以便掌握人類生、老、病、死的奧秘。因此，DNA序列分析技術(shù)與方法，當(dāng)之無(wú)愧成為揭開(kāi)生命之秘的一把金鑰匙。它對(duì)于從分子水平研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及克隆DNA片段，都具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。二十世紀(jì)60年代以前，由于分離分析技術(shù)和研究方法上的限制，DNA序列分析進(jìn)展比較緩慢。為了使DNA核苷酸序列分析成可能，著名華裔生物化學(xué)及分子生物學(xué)家吳瑞士，在196