PCR室室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、PCRg室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 .目的 控制實驗的重復(fù)性、精密度，并檢測其準(zhǔn)確度的改變， 提高本室常規(guī)工作中的批間、批內(nèi)標(biāo)本檢測的一致性。2 .適用范圍本程序適用臨床基因擴(kuò)增檢驗質(zhì)量負(fù)責(zé)人和檢驗人員對DNA和RNA分析的室內(nèi)質(zhì)量控制。3 .制定依據(jù)臨床基因擴(kuò)增檢驗技術(shù)中子瑜 李金明主編 人民衛(wèi)生生版社2002年第一版4 .職責(zé) 實驗室質(zhì)量負(fù)責(zé)人和檢驗人員負(fù)責(zé)本規(guī)程的執(zhí)行。評估檢測結(jié)果正確與否， 判定當(dāng)日結(jié)果是否可以被采用。5、操作步驟5.1 血清質(zhì)量控制品a）質(zhì)控品的來源：衛(wèi)生部臨檢中心或試劑盒內(nèi)質(zhì)控品。b）質(zhì)控品與樣本同時處理，排列順序為：標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，臨床樣本。c

2、）質(zhì)控品的處理及分析判斷。d）實驗結(jié)果的判斷：實驗結(jié)果合格，即發(fā)報告；實驗結(jié)果不 合格，報告室主任，會同有關(guān)人員，查找原因，妥善解決。e）記錄每次檢測質(zhì)控結(jié)果。f）記錄失控原因及糾正措施。5.2 室內(nèi)質(zhì)控圖的使用方法：描點：a）圖中X裝為靶線，X±2s為警告線，X± 3s為失控線。對于同一批號的質(zhì)控血清不論使用幾個月，其空圖均不變化。只要將圖紙上方“起止日期”項填入每個月的實際起止日期即可。b）每天將該批號質(zhì)控血清按有關(guān)規(guī)定程序復(fù)融隨同病人的標(biāo)本同時檢測。將日期、檢測結(jié)果和操作者如實記錄在圖下方的相應(yīng)位置，并按前面的方法畫由圖上的對應(yīng)點，用直線 將該點與前一天的點連接。c）

3、月底計算當(dāng)月全部質(zhì)控血清檢測結(jié)果的X、s和CV,并進(jìn)行圖形分析和小結(jié)，將質(zhì)量控制圖存入質(zhì)控資料檔案。圖形分析a）如果在X± 3s線以外，則為失控，應(yīng)立即報告有關(guān)負(fù)責(zé) 人，迅速查找原因。必要時復(fù)測標(biāo)本，然后方可發(fā)生報告， 并將失控情況、查找過程及處理結(jié)果等詳細(xì)記錄。b）如果在X± 2s線以外，或由現(xiàn)連續(xù) 6點以上在一側(cè)等規(guī) 律變化，均應(yīng)立即向有關(guān)負(fù)責(zé)人反映，并積極查找原因。但 當(dāng)天的檢驗結(jié)果一般可以發(fā)生。通過觀察圖形的規(guī)律性變化進(jìn)行誤差分析，消除誤差來源 a）曲線漂移：提示有系統(tǒng)誤差，準(zhǔn)確度發(fā)生了一次性的向 上或向下改變。這種變化往往是由于一個新的情況引起的。如更換不同批號試

4、劑，啟用新批號的質(zhì)控血清、操作人員的變換等。在找原因時，應(yīng)重點注意“漂移”前后發(fā)生了那些變動的因素。b）趨勢性變化：向下或向上的趨勢性變化表明檢測的準(zhǔn)確 度發(fā)生了漸漸地變化。這種變化往往是由于一個逐漸改變的 因素造成的。如質(zhì)控血清的降解，試劑效價的降低等。c）連續(xù)多點分布在靶值一側(cè)：目前，一般認(rèn)為質(zhì)控血清的檢 測結(jié)果連續(xù)6天以上由現(xiàn)在靶值同一側(cè)，則應(yīng)迅速查找原因， 爭取盡快使之回復(fù)圍繞在靶值隨機(jī)分布的狀態(tài)。因為按照統(tǒng) 計學(xué)原理，由純隨機(jī)誤差造成的這種情況的可能性很小。連 續(xù)6天以上由現(xiàn)在靶值同一側(cè)可能性小于1.5 %。因此凡由現(xiàn)連續(xù)6天以上由現(xiàn)在靶值同一側(cè)者均有可能存在非隨機(jī)誤 差因素。如結(jié)果

5、與靶值偏離并不太大，不會給臨床使用帶來 太大影響時，一般化驗報告可以照常填發(fā)。d）其他規(guī)律變化：（周期性等）5.3 通過圖形的資料對比進(jìn)行誤差分析，消除誤差來源a）每個月的月底將該月的全部質(zhì)控血清檢測基果的 X和s與 該批測定的X和s進(jìn)行比較。如果X發(fā)生了變化，說明準(zhǔn)確 度發(fā)生了變化提示有非隨機(jī)誤差存在。如果當(dāng)月 s不同側(cè)表 明檢測的精密度發(fā)生了變化。b）將使用同一批號質(zhì)控血清的 CT值的X和s按月份列出。 如果X逐在月上升，應(yīng)考慮保存不當(dāng)造成的試劑效價降低或 質(zhì)控血清本身由現(xiàn)降解。如果各月份X基本一致而s逐月加大，則主要提示常規(guī)工作的精密度下降，應(yīng)重點從操作、管 理上找原因。5.4 失控限的

6、判定：當(dāng)陽性對照呈假陰性或陰性質(zhì)控呈假陽性時為失控；當(dāng)陽性標(biāo)本呈假陰性或陰性標(biāo)本呈假陽性時為失控。此次實驗結(jié)果不合格，報告室主任，會同有關(guān)人員，查找原因，妥善解決，并將失控情況、查找過程及處理結(jié)果 等詳細(xì)記錄。5.5 陰性對照品失控的處理程序：5.5.1 陰性對照A、B為假陽性時，則應(yīng)考慮為：a.試劑污染; b. 擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”?？勺饕韵聦嶒炶b定：取4 個空管打開靜置于標(biāo)本制備區(qū)60 分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時以水替代核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增，如為陽性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合物的管為陰性，即可排除試劑污染的可能，表示實驗室有擴(kuò)增產(chǎn)物“污染”。此時，應(yīng)立即報告實驗室負(fù)責(zé)人，然后先暫時停止 PC

7、R實驗，采取各種有效的消毒清潔工作直 至產(chǎn)物污染徹底消失后才可進(jìn)行PCR實驗。如果有試劑污染時，應(yīng)更換另一批號的試劑進(jìn)行重復(fù)實驗，待重復(fù)實驗陰性質(zhì)控品無失控后，方可報告結(jié)果。5.5.2 如果以上實驗鑒定沒有實驗室的產(chǎn)物污染時，則應(yīng)判斷為實驗操作過程中所致的標(biāo)本間的交叉“污染”，出現(xiàn)這種情況很大程度上屬于偶然誤差，具體地說，如強(qiáng)陽性的標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染，強(qiáng)陽性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用的離心管核酸提取時在較高溫度溫育時蓋子崩開。因此在PCR實驗前離心管、濾心吸頭的質(zhì)檢以及在實驗中一發(fā)現(xiàn)手套可能有污染就立即更換手套顯得尤為重要，并且PCRU驗人員的嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行實驗的工作態(tài)度

8、是實驗成敗的關(guān)鍵。5.6 陽性對照品失控的處理程序：5.6.1 臨界陽性對照品失控的原因有：a. 臨界對照品是否還好：可更換新的臨界對照品，進(jìn)行重復(fù)實驗，如果對照品無失控則表示上次實驗的臨界對照品已失效， 不能再用于實驗。如果還有失控現(xiàn)象，則應(yīng)考慮：b. 核酸提取過程中的隨機(jī)誤差：如核酸性對照失控。如核酸提取中的丟失、裂解溫度不夠、裂解不充分、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。應(yīng)重新嚴(yán)格核查該過程中的各步驟是否出錯，然后重新操作一遍，臨界對照品無失控現(xiàn)象后才報告結(jié)果。如果仍失控，則考慮：儀器問題b. 儀器問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。此時應(yīng)請廠

9、家及時校正儀器。儀器校正好之后再重復(fù)操作如無失控則可報告結(jié)果。如果仍有失控現(xiàn)象則應(yīng)考慮：試劑問題c. 試劑的問題：如Taq 酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率、試劑的靈敏度等。可更換另一批號的試劑重復(fù)實驗，無失控結(jié)果后才可發(fā)出報告。5.6.2 強(qiáng)陽性對照品失控的原因和臨界陽性對照品失控的原因基本相同，但最首要的原因應(yīng)考慮試劑的問題。由此可見，在PCR實驗前對試劑的質(zhì)檢是必不可少的環(huán)節(jié)之一。5.7 陽性標(biāo)本失控的處理程序：5.7.1 失控的主要原因有：a. 標(biāo)本的收集是否符合要求（包括標(biāo)本采集的時間是否合適、標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備工作是否適度、標(biāo)本的類型和采集量是否合適、采集的標(biāo)本所

10、含的細(xì)胞數(shù)量和核酸總量是否足夠、采樣容器是否合格。） ；b. 標(biāo)本保存是否正確；c. 標(biāo)本的運送是否延誤；d. 標(biāo)本在核酸制備、擴(kuò)增檢測中所存在的隨機(jī)誤差（與上述陽性質(zhì)控品的失控原因相同）。5.7.2 處理程序：a. 如果是標(biāo)本收集、標(biāo)本保存、標(biāo)本運送等環(huán)節(jié)所導(dǎo)致陽性標(biāo)本失控，則應(yīng)嚴(yán)格按要求重取標(biāo)本后復(fù)查才可報告結(jié)果。另外還應(yīng)對臨床標(biāo)本采集人員、標(biāo)本運送相關(guān)人員進(jìn)行必要的培訓(xùn)。b. 如果是標(biāo)本的核酸制備、擴(kuò)增檢測中所存在的隨機(jī)誤差問題，則可參照以上所述陽性質(zhì)控品失控的處理方法，另外對PCR實驗人員的培訓(xùn)非常重要。5.8 陰性標(biāo)本失控的處理程序：5.8.1 主要原因有：a. 標(biāo)本采集容器是否合格（是否使用一次性采樣材料、使用的玻璃器皿是否經(jīng)過高壓滅菌）；b. 標(biāo)本運送過程是否存在污染因素（如沒有密閉、管漏等）c. 標(biāo)本在核酸制備、擴(kuò)增檢測中所存在的隨機(jī)誤（與上述陰性質(zhì)控品的失控原因相同）5.8.2 處理程序：a.