植物組織中淀粉含量的測(cè)定

1、植物組織中淀粉含量的測(cè)定2007-01-1208:55I慈酮硫酸法一、原理淀粉是由葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱使其水解成葡萄糖，然后在濃硫酸的作用下，使單糖脫水生成糠醛類(lèi)化合物，利用慈酮試劑與糠醛化合物的顯色反應(yīng)，即可進(jìn)行比色測(cè)定。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料任何植物材料。（二）試劑濃硫酸（比重1.84）。9.2mol/LHClO4。2%意酮試劑，同實(shí)驗(yàn)24。（三）儀器設(shè)備電子天平，容量瓶：100mL4個(gè)、50mL2個(gè)，漏斗，小試管若干支，電爐，刻度吸管0.5mL1支、2.0mL3支、5mL4支，分光光度計(jì)，記號(hào)筆。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作取小試管11支從010編號(hào)

2、，按表24-3加入溶液和蒸儲(chǔ)水。以下步驟按苯酚法或慈酮法均可，見(jiàn)方法一或方法二，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。表24-3各試管加入標(biāo)準(zhǔn)液和蒸儲(chǔ)水量管號(hào)910淀粉標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.40.81.21.62.0蒸儲(chǔ)水（ml）2.01.61.20.80.40淀粉含量（mg）040801201602002 .樣品提取稱(chēng)取50100mg粉碎過(guò)100目篩的烘干樣品，置于15mL刻度試管中，加入67mL80%乙醇，在80c水浴中提取30min,取出離心（3000rpm）5min,收集上清液。重復(fù)提取兩次（各10min）同樣離心，收集三次上清液合并于燒杯，置于85C恒溫水浴，使乙醇蒸發(fā)至23mL,轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，

3、以蒸儲(chǔ)水定容，供可溶性糖的測(cè)定。向沉淀中加蒸儲(chǔ)水3mL,攪拌均勻，放入沸水浴中糊化15min。冷卻后，力口入2mL冷的9.2mol/L高氯酸，不時(shí)攪拌，提取15min后加蒸儲(chǔ)水至10mL,混勻，離心10min,上清液傾入50mL容量瓶。再向沉淀中加入2mL4.6mol/L高氯酸，攪拌提取15min后加水至10mL,混勻后離心10min,收集上泊于容量瓶。然后用水洗沉淀12次，離心，合并離心液于50mL容量瓶用蒸儲(chǔ)水定容供測(cè)淀粉用。3 .測(cè)定取待測(cè)樣品提取液1.0mL于試管中，再加慈酮試劑5mL,快速搖勻，然后在沸水浴中煮10min,取出冷卻，在620nm波長(zhǎng)下，用空白調(diào)零測(cè)定光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

4、查出淀粉含量（mg）。四、結(jié)果計(jì)算：含量（）=100*C*VT/V1*1000*W式中：C從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得淀粉量,mgV T樣品提取液總體積，mL0V 1顯色時(shí)取樣品液量，mL1W樣品重，g。0.9由葡萄糖換算為淀粉的系數(shù)n碘-淀粉比色法一、原理對(duì)于淀粉含量較少的植株樣品，也可采用碘就粉比色法。淀粉在加熱情況下能溶于硝酸鈣溶液中，當(dāng)?shù)饣浐拖跛徕}共存時(shí)，碘能以碘求粉藍(lán)色化合物沉淀全部淀粉。將此沉淀溶于堿液，并在酸性條件下與碘作用形成藍(lán)色溶液進(jìn)行比色。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實(shí)驗(yàn)材料任何植物材料。（二）試劑1 .80%硝酸鈣溶液。2 .0.5%碘液：稱(chēng)5.00g結(jié)晶碘和10.00g碘化鉀

5、，放入研缽混合干研，然后加10mL蒸儲(chǔ)水研至全部碘溶解，將溶液全部轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶定容后，貯于磨口試劑瓶。</P>3 .5%含碘硝酸鈣溶液：取10mL80%的硝酸鈣溶液，加入160mL水再加入3mL0.5%的碘液混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。4 .標(biāo)準(zhǔn)淀粉溶液：稱(chēng)取純淀粉50mg于研缽中，力口3mL80%硝酸鈣溶液，研細(xì)并轉(zhuǎn)移到100mL的三角瓶中，用15mL80%的硝酸鈣溶液沖洗研缽，無(wú)損地收集于三角瓶中。將三角瓶置于沸水浴中煮沸5min,冷卻后全部轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中并定容。此液為1mg/mL的淀粉標(biāo)準(zhǔn)液。5 .0.1mol/LNaOH。6 .0.1mol/LHCl。（三）儀器設(shè)備分析

6、天平，研缽，容量瓶，量筒，三角瓶，水浴，小漏斗，電爐，離心機(jī)，離心管，試劑瓶。三、實(shí)驗(yàn)步驟1 .稱(chēng)取13g葉片，剪碎放入研缽，力口5mL80%的硝酸鈣溶液，研磨成糊狀移入100mL的三角瓶中，用10mL80%的硝酸鈣沖洗研缽，無(wú)損地收集于三角瓶中，瓶口蓋上小漏斗，在沸水浴上煮沸35min（葉片含淀粉少的3min,含淀粉多的5min）,使樣品中淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)槟z體溶液。2 .給三角瓶中加20mL蒸儲(chǔ)水，混合液轉(zhuǎn)入離心管中離心（20003000rpm）23min,將離心后的淀粉膠體渾濁液移入100mL容量瓶（淀粉含量少時(shí)，可移入50mL容量瓶），三角瓶及離心沉淀物用510mL熱蒸儲(chǔ)水沖洗并同樣離心，離心

7、液并入容量瓶中（共洗23次）定容，即為淀粉提取液。3 .取510mL淀粉待測(cè)液，加入到盛有2mL0.5%碘液的離心管中，混勻靜置15min后離心（3000rpm）5min,棄上清液。沉淀用5%的含碘硝酸鈣溶液沖洗兩次，向沖洗后的沉淀中加入10mL0.1mol/L的NaOH混勻，將離心管浸入沸水內(nèi)5min,使沉淀溶解。將溶液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，加入0.3mL0.5%碘液，用30mL左右的水沖洗并入容量瓶，加入2mL1mol/L的鹽酸，用水定容并顯色，在590nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度。4 .繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)取標(biāo)準(zhǔn)淀粉溶液（1mg/mL）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6個(gè)離心管中

8、，用80%硝酸鈣溶液將各管的體積補(bǔ)足至5mL,再向各管加入2mL0.5%碘液，混勻靜置15min后離心，其他操作同樣品測(cè)定步驟，顯色后在590nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。此系列溶液的淀粉含量分別為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg,然后以光密度為橫坐標(biāo)，以淀粉含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。四、結(jié)果計(jì)算：含量（）=100*C*VT/V1*1000*W式中：C從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得淀粉量，mgoV T樣品提取液總體積，mL0V 1顯色時(shí)取樣品液量，mL0W樣品重（g）。III旋光法（谷物淀粉含量的測(cè)定）一、原理：酸性氯化鈣溶液與磨細(xì)的含淀粉樣品共煮，可使淀粉輕度水解。同時(shí)鈣離子與淀粉分子上的羥基

9、絡(luò)合，這就使得淀粉分子充分地分散到溶液中，成為淀粉溶液。淀粉分子具有不對(duì)稱(chēng)碳原子，因而具有旋光性，可以利用旋光儀測(cè)定淀粉溶膠的旋光度（&,旋光度的大小與淀粉的濃度成正比，據(jù)此可以求出淀粉含量。溶提淀粉溶膠所用的酸性氯化鈣溶液的pH值必須保持2.30,密度須為1.30,加時(shí)間的長(zhǎng)短也要控制在一定范圍。因?yàn)橹挥性谶@些條件下，各種不同來(lái)源的淀粉溶液的比旋度田才都是203°,恒定不變。樣品中其他旋光性物質(zhì)（如糖分）須預(yù)先除去。二、材料、儀器設(shè)備及試劑：（一）材料：面粉或其他風(fēng)干樣品（二）儀器設(shè)備：1.植物樣品粉碎機(jī)；2.離心機(jī)；3.分析天平；4.粗天平；5.旋光儀及附件；6.三角瓶；

10、7.分樣篩（100目）；8.布氏漏斗、抽濾瓶及真空泵；9.離心管；10.小電爐。（三）試劑：三、實(shí)驗(yàn)步驟：1 .樣品準(zhǔn)備：（1）稱(chēng)取樣品：將樣品風(fēng)干、研磨、通過(guò)100目篩，精確稱(chēng)取約2.5g樣品細(xì)粉（要求含淀粉約2g,請(qǐng)參考附注估計(jì)），置于離心管內(nèi)。（2）脫脂：加乙醴數(shù)ml到離心管內(nèi)，用細(xì)玻棒充分?jǐn)嚢?，然后離心。傾出上清液并收集以備回收乙醴。重復(fù)脫脂數(shù)次，以去除大部分油脂、色素等（因油脂的的存在會(huì)使以后淀粉溶液的過(guò)濾困難）。大多數(shù)谷物樣品含脂肪較少，可免去這個(gè)脫脂手續(xù)。（3）抑制酶活性：加含有氯化高汞的乙醇溶液10ml到離心管內(nèi)，充分?jǐn)嚢?，然后離心，傾去上清液，得到殘余物。（4）脫糖：加80%

11、乙醇10ml到離心管中，充分?jǐn)嚢枰韵礈鞖堄辔铮看味加猛徊０簦?，離心，傾去下清液。重復(fù)洗滌數(shù)次以去除可溶性糖分。2 .溶提淀粉：（1）加醋酸氯化鈣：先用醋酸氯化鈣溶液約10ml加到離心管中，攪拌后全部?jī)A入250ml三角瓶?jī)?nèi)，再用醋酸氯化鈣溶液50ml分?jǐn)?shù)次洗滌離心管，洗滌液并入三角瓶?jī)?nèi)，攪拌玻棒也轉(zhuǎn)移到三角瓶?jī)?nèi)。（2）煮沸溶解：先用蠟筆標(biāo)記液面高度，直接置于加有石棉網(wǎng)的小電爐上，在4min5min內(nèi)迅速煮沸，保持沸騰15min17min,立即將三角瓶取下，置流水中冷卻。煮沸過(guò)程中要時(shí)加攪拌，勿令燒焦；要調(diào)節(jié)溫度，勿使泡沫涌出瓶外；常用玻璃將瓶側(cè)的細(xì)粒擦下；并加水保持液面高度。3 .沉淀雜質(zhì)和

12、定容：（1）加沉淀劑：將三角瓶?jī)?nèi)的水解液轉(zhuǎn)入100ml容量瓶，用醋酸氯化鈣溶液充分洗滌三角瓶瓶，并入容量?jī)?nèi)，加30%ZnS041ml混合后，再加15%K4Fe（CN）61ml,用水稀釋至接近刻度時(shí)，力口95%乙醇一滴以破壞泡沫，然后稀釋到刻度，充分混合，靜置，以使蛋白充分沉淀。（2）濾清：用布氏漏斗（加一層濾紙）吸氣過(guò)濾。先傾清溶液約10ml于此濾紙上，使其完全濕潤(rùn)，讓溶液流干，棄去濾液，再傾清溶液進(jìn)行過(guò)濾，用干燥的容器接受此濾液，收集約50ml,即可供測(cè)定之用。4 .測(cè)定旋光度：用旋光測(cè)定管裝滿(mǎn)濾液，小心地按照旋光儀使用說(shuō)明，進(jìn)行旋光度的測(cè)定。淀粉（）=aXNX100/20向祖XWK）M00

13、式中：0c用鈉光時(shí)觀測(cè)到的旋光度；m20D:淀粉的比旋度，在這種方法條件下為203°L:旋光管長(zhǎng)度（cm）;W:樣品質(zhì)量（g）;K:樣品水分含量（%）;N:稀釋倍數(shù)；100:換算為百分率。也可以不用上列公式計(jì)算，改用工作曲線(xiàn)來(lái)求得淀粉含量，這樣準(zhǔn)確度高些。田、淀粉含量的測(cè)定目的掌握植物組織中淀粉含量測(cè)定的原理和方法。二、原理淀粉用鹽酸水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖后，測(cè)定葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖含量換算成淀粉含量。三、材料、儀器設(shè)備及試劑材料、儀器設(shè)備及試劑與上述蔗糖的測(cè)定相同，另增加碘試劑；100ml、250ml容量瓶。碘試劑（碘化鉀一碘溶液）的配制：稱(chēng)取碘化鉀20g及碘10g溶于100ml蒸儲(chǔ)水

14、中。使用前需稀釋10倍。四、實(shí)驗(yàn)步驟1 .葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作與上述還原糖含量測(cè)定相同。2 .淀粉的水解取上述還原糖含量測(cè)定中經(jīng)85%乙醇浸提后的全部淀粉殘?jiān)湃?00ml三角瓶中，加入6mol-L1鹽酸10ml,混勻，在沸水浴中加熱10min-30min（用碘試劑檢查淀粉水解程度，直至不顯藍(lán)色為止），再加蒸儲(chǔ)水20ml,搖勻并過(guò)濾于100ml容量瓶中，過(guò)濾后殘?jiān)儆谜魞?chǔ)水沖洗3次，一并過(guò)濾入容量瓶，定容至100ml。準(zhǔn)確取出10ml過(guò)濾液置入250ml容量瓶中，加酚酗：2滴，用10%NaOM和至微紅色，用蒸儲(chǔ)水定容至250ml,待測(cè)。3 .還原糖含量測(cè)定取4支25ml刻度試管，編號(hào)，其中3支（三個(gè)重復(fù)）分別加入待測(cè)液2ml,1支空白管加2ml蒸儲(chǔ)水代替樣品液，然后各管再加入DNS試劑1.5ml,搖勻，混合液在沸水浴中加熱5min,然后用自來(lái)水