脯氨酸含量的測(cè)定

1、脯氨酸含量的測(cè)定在逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸proline , Pro的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量 在一定程度上反映了植物的抗逆性， 抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。 因此測(cè)定脯氨 酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。 另外， 由于脯氨酸親水性極強(qiáng)， 能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及 組織內(nèi)的代謝過(guò)程， 因而能降低凝固點(diǎn)， 有防止細(xì)胞脫水的作用。 在低溫條件下， 植物組織 中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。一、原理當(dāng)用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)， 脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中， 然后用酸性茚 三酮加熱處理后，溶液即為紅色，再用甲苯處理， 那么色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯

2、中，色素的深淺即 表示脯氨酸含量的上下。在 520nm 波長(zhǎng)下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出或用回歸方程計(jì)算 脯氨酸的含量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑一材料待測(cè)植物葉片二儀器設(shè)備1. 722 型分光光度計(jì)；2. 研缽；小燒杯；4. 容量瓶；5. 大試管；6. 普通試管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴鍋；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 濾紙；13. 剪刀。三試劑1酸性茚三酮溶液：將茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l磷酸中，攪拌加熱70C 溶解，貯于冰箱中。2. 3%磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。3冰醋酸。4.甲苯。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 1

3、在分析天平上精確稱取 25mg 脯氨酸，倒入小燒杯中內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然 后倒入 250ml 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每毫升含脯氨酸100ug。 2系列脯氨酸濃度的配置： 取 6個(gè) 50ml 容量瓶，分別參加脯氨酸原液、 1.0ml、1.5ml、 2.0ml、2.5ml 及，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml 、 4ug/ml 、 5ug/ml 及 6ug/ml 。 3取 6 支試管，分別吸取 2ml 系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及 2ml 冰醋酸和 2ml 酸性 茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱 30min。4冷卻后各試管準(zhǔn)

4、確參加 4ml甲苯，振蕩30s，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。5用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，于520nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值Y依脯氨酸濃度X而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量ug/2ml。2樣品的測(cè)定1脯氨酸的提取：準(zhǔn)確稱取不同處理的待測(cè)植物葉片各，分別置大管中，然后向各 管分別參加3%的磺基水楊酸溶液 5ml，在沸水浴中提取 10min提取過(guò)程中要經(jīng)常搖動(dòng)： 冷卻后過(guò)濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。2吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，參加2ml冰醋酸及2ml

5、酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱 30min，溶液即呈紅色。3冷卻后參加4ml甲苯，搖蕩30s,靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000r/min 下離心5min。4用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分 光光度計(jì)上520nm波長(zhǎng)處比色，求得吸光度值。四、結(jié)果計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算出或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量 X，ug/2ml， 然后計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：QQ z QQQQ單位鮮質(zhì)量樣品的脯氨酸含量=? ；?陽(yáng)和00式中：X為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出的 2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量ug/2ml；Vt為提取液體積ml；Vs為測(cè)定時(shí)取

6、用的樣品體積 ml；W為樣品質(zhì)量g。植物體內(nèi)硝酸復(fù)原酶活力的測(cè)定硝酸復(fù)原酶NR，是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸?鹽，NO3-+ NADH+ H+tNO2- + NAD+ H2O。產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對(duì) -氨基苯磺酸或?qū)?氨基苯磺酰胺a -萘胺或萘基乙烯二胺在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在 540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。硝酸復(fù)原酶活 性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以u(píng)g氮/ g - h為單位。NR的測(cè)定可分為活體法和離體法。活體法操作簡(jiǎn)單，適合快速、多組測(cè)定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性好。離體法一、材料、儀器設(shè)備及試劑一材料水稻、小麥

7、葉片、幼穗等。二儀器設(shè)備1冷凍離心機(jī)2分光光度計(jì)3天平感量4冰箱5恒溫水浴6. 研缽7剪刀8離心管9具塞試管10移液管11.吸爾球。三試劑1亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取分析純Na溶于去離子水后定容至 1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即為含亞硝態(tài)氮 1ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。2. /I pH的磷酸緩沖液：Na2HPO4 12 H2O與NaH2PO4 2 H2O加去離子水溶解后定容至 1000ml。3. 1%質(zhì)量濃度磺胺溶液：磺胺溶于100ml 3mol/l鹽酸中25ml濃鹽酸加水定容至100ml 即為 3mol/l HCI。4. 0.02%質(zhì)量濃度萘基乙烯胺溶液：萘基乙烯胺溶于100

8、ml去離子水中，貯于棕色瓶?jī)?nèi)。溶液：g KNO3溶于250ml的磷酸緩沖液。的磷酸緩沖液：Na2HPO4 12 H2O, K2HPO4 3H2O溶于1000ml去離子水中。7. 提取緩沖液：半胱氨酸，EDTA溶于100ml的磷酸緩沖液中。8. 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml的磷酸緩沖液中臨用前配制。二、實(shí)驗(yàn)步驟一標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按下表順序參加試劑，配成0的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在25C下保溫30min，然后在540nm下比色測(cè)定。以亞硝態(tài)氮ug為橫坐標(biāo) X，吸光度值為縱坐標(biāo)Y建立回歸方程。配置標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)各物質(zhì)參加量試劑/ml12管3號(hào)4

9、567亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水2.01.81.61.20.80.401%磺胺44444440.02%萘基乙烯胺4444444每管含亞硝態(tài)氮/ug二樣品中硝酸復(fù)原酶活力測(cè)定1. 酶的提?。悍Q取鮮樣，剪碎于研缽中置于低溫冰箱冰凍30min，取出置于冰浴中加少量石英砂及4ml提取緩沖液，研磨勻漿，轉(zhuǎn)入離心管在4C、4000r/min下離心15min，上清液即為粗酶提取液。2. 酶的反響：取粗酶液于 10ml試管中，參加磷酸緩沖液和NADH溶液，混勻，在25 C 水浴中保溫30min，對(duì)照不加NADH溶液，而以的磷酸緩沖液代替。3. 終止反響和比色測(cè)定： 保溫結(jié)束后立即參加 1ml磺胺溶液終止酶反響， 再

10、加1ml萘基 乙烯胺溶液，顯色15min后于4000r/min下離心15min ,取上清液在540nm下比色測(cè)定。根 據(jù)回歸方程計(jì)算出反響液中所產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量ug。三、結(jié)果計(jì)算樣品中硝酸復(fù)原酶活性u(píng)g/ g?h=?務(wù)?其中：x 為反響液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量ug；VT為提取酶時(shí)參加的緩沖液體積ml；Vs為酶反響時(shí)取用的粗酶液體積ml；W 為樣品鮮質(zhì)量 g；t 為反響時(shí)間 h。根系活力的測(cè)定TTC法植物根系是活潑的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上局部 的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。一、原理氯化三苯基四氮唑TTC是標(biāo)準(zhǔn)氧化復(fù)原電位為 80mV的氧化復(fù)原色素，溶于水中成 為

11、無(wú)色溶液，但復(fù)原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙。生成的三苯甲腙比擬穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC復(fù)原，可因參加琥珀酸、延胡索酸、蘋(píng)果酸得到增強(qiáng)，而被丙二醛、碘乙酸所抑制。所以TTC復(fù)原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指 標(biāo)。二、材料、設(shè)備儀器及試劑一材料 水培或沙培小麥、玉米等植物根系。二儀器設(shè)備1. 分光光度計(jì)2. 分析天平感量3. 電子頂載天平感量4. 溫箱5. 研缽三角瓶7.漏斗量筒吸量管刻度試管11.試管架12.10ml 容量瓶13.藥勺14. 石英砂適量、 1000ml 燒杯。三試劑1.乙酸乙酯分析純2次硫酸鈉

12、Na2S2O4，分析純，粉末。3. 1%TTC溶液：準(zhǔn)確稱取，溶于少量水中，定容至100ml。用時(shí)稀釋至所需要的各種濃度。4磷酸緩沖液1/15mol/l pH7：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀 KH2PO4，加1mol/l NaOH溶液， 并加水定容至1000ml或者1/15mol/l的磷酸氫二鈉：稱取 Na2HPO4 12 H2O蒸餾水定容 至1000ml; 1/15mol/l的磷酸二氫鉀：稱取分析純KH2PO4,用純水定容至 1000ml。pH7的磷酸緩沖液即為取 1/15mol/l的磷酸氫二鈉12ml, 1/15mol/l的磷酸二氫鉀8ml，兩者混合即可。5. 1mol/l硫酸：用量筒取相對(duì)質(zhì)量的濃硫酸55ml，邊攪拌邊參加盛有 500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至 1000ml。三、實(shí)驗(yàn)步驟定量測(cè)定1TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取 0.4%TTC溶液放入10ml試管中，加少許 Na2S2O4粉末 搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25ug、50ug、100ug、150ug、200ug的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2稱取根尖樣品0.2,放入