RNA提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)

1、一、槍頭和EP管等的消毒滅菌1、用去離子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（劇毒物），須在通風(fēng)櫥中小心使用，避光，密閉4c保存；DEPC水是用DEPC（diethypyrocarbonate,焦碳酸二乙酯）處理過(guò)弁經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。經(jīng)檢測(cè)不含RNase、DNase和proteinase。2、將槍頭和EP管放入0.1%的DEPC內(nèi)，保證槍頭和EP管內(nèi)都充滿0.1%的DEP,3、避光、靜置、過(guò)夜（12-24h）4、裝槍頭和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，將槍頭或者EP管內(nèi)的DEPC水大致去除干后，裝起，包好5、121攝氏度，30min6、180攝氏度，干燥數(shù)個(gè)鐘頭（至少3小時(shí)以上

2、）。注意：a、處理DEPC時(shí)需要戴乳膠手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，130C,90min高壓滅菌（許多實(shí)驗(yàn)室高溫滅菌兩次）二、RNA提取注意事項(xiàng)1、組織RNA抽提失敗的兩大現(xiàn)象是：RNA降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問(wèn)題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提RNA不容易降解?，F(xiàn)有的RNA抽提試劑，都含有快速抑制Rnase的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡(jiǎn)單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹底裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的Rnase,所以RNA得以保持完整。也就是說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其RNA不容易被降解；反過(guò)來(lái)講，組織中

3、的RNA之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制RNA活性的同精品文檔，歡迎下載1/11時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞,降解問(wèn)題也就可以徹底解決了液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時(shí)候更加會(huì)有此感覺(jué)。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒(méi)有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制Rnase活性這個(gè)問(wèn)題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的Rnase降解RNA的速度快。電動(dòng)勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來(lái)說(shuō)，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來(lái)用電動(dòng)勻漿器的，改用液

4、氮碾磨；原來(lái)用玻璃勻漿器的，改用電動(dòng)勻漿器或者直接用液氮碾磨，問(wèn)題幾乎100%能獲得解決。影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)殘留問(wèn)題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同?？傊?，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對(duì)具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場(chǎng)上購(gòu)買一些魚(yú)/雞之類的小動(dòng)物，取相應(yīng)部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì)-用嘴碾磨，腸胃抽提。2、抽提RNA的目的RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求RNA完整而無(wú)的反應(yīng)抑制物殘留；Northern對(duì)RNA完整性要求較高，對(duì)幅反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR對(duì)RN

5、A完整性要求不太高，但對(duì)幅反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的RNA為目的，勞民傷財(cái)。3、樣品的收集/保存-影響降解的因素樣品離開(kāi)活體/或者原來(lái)的生長(zhǎng)環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開(kāi)始降解RNA,降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來(lái)，再往下做。4、樣品的破碎及勻漿-影響降解和得率的因素樣

6、品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使RNA徹底完整地釋放出來(lái)。細(xì)胞無(wú)須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過(guò)勻漿器一次完成破碎和勻漿過(guò)程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開(kāi)操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動(dòng)勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過(guò)程中，樣品不得融化，因?yàn)槔鋬龊髢?nèi)源酶更容易起作用。5、裂解液的選擇-影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用

7、的裂解液幾乎都能抑制Rnase活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。6、純化方法的選擇-影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素對(duì)于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對(duì)于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)的反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長(zhǎng)。7、RNA抽提的“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意”紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。

8、注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。注意二：實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。注意三：實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。注意五：選擇合適的裂解液。注意六：控制好樣品的起始量。紀(jì)律三：明確自己的抽提目的注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。注意八：RNA抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功，而不是得率。8、RNase污染的10大來(lái)源1）手指頭，手指頭是外源酶的第一來(lái)源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的的來(lái)源。戴手套

9、口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。2）槍頭，離心管，移液器-單純的滅菌是不能滅活Rnase的，所以槍頭和離心管要用DEPC處理，即使是標(biāo)明為DEPC處理過(guò)的。移液器最好是專用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。3）水/緩沖液一定要確保無(wú)Rnase污染。4）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面最起碼要用75%的酒精棉球搽拭干凈。5）內(nèi)源Rnase所有組織均含內(nèi)源幅，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。精品文檔，歡迎下載4/11液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對(duì)有一些內(nèi)源的含量很高的組織，卻是唯一的辦法。6) RNA樣品RNA抽提產(chǎn)物可能都會(huì)含痕量的Rnase污染。77質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往

10、往用到Rnase降解RNA,殘留的Rnase要用ProteinaseK消化，PCI抽提。8) RNA保存即使低溫保存，痕量的Rnase亦會(huì)導(dǎo)致RNA降解。長(zhǎng)期保存RNA的最好辦法是鹽/醇懸液，因?yàn)榇荚诘蜏貢r(shí)抑制所有的酶活性。9)陽(yáng)離子(Ca,Mg)在含這些離子時(shí)，80C加熱5分鐘會(huì)導(dǎo)致RNA被剪切，故如果RNA需要被加熱，保存液需要含螯合劑(1mMSodiumCitrate,pH9) 4)。10)后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的幅幅均有可能被Rnase污染。9、RNA抽提的10大竅門1:快速阻止Rnase活性樣品收集后快速冷凍，裂解時(shí)快速操作滅活Rnase2:選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含

11、苯酚的方法。3:預(yù)判質(zhì)量要求Northern,cDNA文庫(kù)構(gòu)建對(duì)完整性要求高，RT-PCR,RPA(Ribonucleaseprotectionassa)y對(duì)完整性要求不是很高。RT-PCR對(duì)純度(幅抑制物殘留)要求很高。4:徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。5:檢查RNA的完整性電泳檢測(cè)，28S:18S=2:1是完整的標(biāo)志，1:1對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)也是可以接受的。6:去除DNA用于RT-PCR,arrayanalysis最好用DnaseI去除DNA。7:降低外源酶的污染不能從外面又導(dǎo)入酶8:低濃度的核酸濃縮時(shí)，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及DNA污染。9:徹底溶解RNA,必要時(shí)可以65

12、C加熱5分鐘。10:合適的保存方法-短時(shí)間可以-20C保存，長(zhǎng)期請(qǐng)保存于-80C。提高RNA得率首先要意識(shí)到不同得樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度(<0.05ug/mg)的如膀胱，骨，脂肪。1:裂解細(xì)胞使RNA釋放出來(lái)-RNA如果不被釋放出來(lái)，得率是會(huì)降低的。電動(dòng)勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結(jié)合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化(Lysozyme/Lyticase)2:抽提方法的優(yōu)化。基于苯酚的方法的最大問(wèn)題是分層不徹底和部分RNA的丟失(不能全部將上清取出)。分層

13、不徹底是因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。RNA的丟失可以用反抽方法或者去除有機(jī)層后再離心的方法降低。基于柱離心式方法的最大問(wèn)題是樣品過(guò)量。10、經(jīng)典抽提小技巧1） Phenol純化：將等體積的1:1Phenol/Chloroform加入，劇烈混允1-2分鐘。精品文檔，歡迎下載6/11高速離心2分鐘。小心取上清（80-90%）。決不能取到中間層。可以使用等體積的反應(yīng)液加入Phenol/Chloroform中，同樣再取出上清。將兩次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率?；煸蕰r(shí)不能太溫和，也不要試圖取出全部上清。2） 70-80%乙醇

14、洗滌：洗滌時(shí)，一定要將核酸懸浮起來(lái)，才能保證殘留的鹽被洗去。同時(shí)，在倒掉乙醇后，立即高速離心數(shù)秒，再用移液器去除殘留的乙醇。室溫靜置5-10分鐘后，溶解。11、特殊組織的抽提1）纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織抽提RNA關(guān)鍵在徹底破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，故單位重量的組織RNA的含量就少，最好用盡可能多的起始量。一定要在冷凍條件下將組織徹底磨碎。2）蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，PCI抽提后，上清含白色絮狀物。必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。3）核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷凍條件下碾磨組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。但如果裂解液太粘稠（因?yàn)楹怂岷?/p>

15、量高的緣故），PCI抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問(wèn)題。多次PCI抽提可以去除更多殘留的DNA。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有DNA污染。溶解后用酸性PCI再次抽提，可以去除DNA污染。4）植物組織：植物組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜。一般，大家都是在液氮條件下對(duì)植物進(jìn)行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使RNA降解的現(xiàn)象不常見(jiàn)。如果降解問(wèn)題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物的內(nèi)含雜質(zhì)都會(huì)導(dǎo)致目前，商品化的 RNA但卻沒(méi)有一種商品化的殘留，之所以殘留，往往是因?yàn)檫@些雜質(zhì)與RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀,你吸附我吸附。這些特點(diǎn)決定了它們是非常強(qiáng)的的抑制劑。抽提試劑經(jīng)過(guò)小量調(diào)整

16、，可以適合幾乎所有的動(dòng)物組織,RNA抽提試劑，可以適合大部分植物組織。12、樣品凍融的影響冷凍的樣品可能較大，用于抽提RNA之前，需要切割。切割過(guò)程中樣品往往出現(xiàn)融化（可能是部分融化）。冷凍的樣品抽提RNA前可能還要稱重，這個(gè)過(guò)程肯定會(huì)出現(xiàn)融化。有時(shí)候，液氮碾磨過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)樣品的融化；或者冷凍樣品不經(jīng)過(guò)液氮碾磨直接加入裂解液中，在徹底勻漿前肯定會(huì)出現(xiàn)融化。實(shí)驗(yàn)表明，冷凍組織在融化過(guò)程中比新鮮組織更容易發(fā)生RNA的降解。可能的原因是：凍融過(guò)程破壞了細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，使內(nèi)源幅更容易與RNA接接觸。13、RNA質(zhì)量的判斷通常，使用電泳判斷RNA的完整性，使用A260/A280判斷RNA的純度。理論上，

17、完整的RNA擁有28S:18S=2.7:1的比例，大部分資料則強(qiáng)調(diào)28S:18S=2:1的比例。事實(shí)是，除了細(xì)胞外，從其它樣品中抽提的RNA幾乎都得不到2:1的比例（此結(jié)論使用AgilentBioanalyzer族得）。RNA的電泳結(jié)果受許多因素的影響，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)，電泳條件，上樣量，被EB飽和的程度等。使用非變性電泳檢測(cè)RNA,以DNAMarker做對(duì)照，如果2kb處的28S和0.9kb處的18S條帶清晰，且28S:18S>1,該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求了。A260/A280是一個(gè)給大家?guī)?lái)許多困惑的指標(biāo)。首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的RNA，其A260/280=

18、2.0左右。純RNA是因，A260/A280=2是果'?，F(xiàn)在大家卻在拿A260/A280當(dāng)因用，認(rèn)為“如果A260/A280=2,所以RNA是純的"，自然會(huì)產(chǎn)生困惑。有興趣的話，可以在您的RNA樣品中加入一點(diǎn)抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚，異硫氟酸服，PEG等，再測(cè)A260/A280比值?，F(xiàn)實(shí)是，許多抽提RNA時(shí)使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在A260和A280處附近有吸收，對(duì)A260/A280產(chǎn)生影響。目前最具有指導(dǎo)性的做法是：對(duì)RNA樣品在200-300nm范圍掃描。純RNA的曲線具有如下特點(diǎn)：曲線平滑，A230和A260是兩個(gè)拐點(diǎn)，A300接近0,A260/A280=2.0左右，A260/A230=2.0左右。如果沒(méi)有掃描數(shù)據(jù)，也一定要測(cè)定A260/A230比值，因?yàn)樵摫戎祵?duì)所有影響的反應(yīng)的雜質(zhì)的殘留更敏感。要考慮設(shè)備的線形范圍（A260要處于0.1-0.5之間）。另外有兩個(gè)有用的現(xiàn)象：在水中測(cè)定A260/A280,比值將變低0.3左