2022年細菌分類鑒定方法的研究進展

1、細菌分類鑒定方法的研究進展目錄細菌分類鑒定方法的研究進展4摘 要4ABSTRATC51、引言51.1細菌分類鑒定51.1.1 細菌常規(guī)鑒定方法5細菌的數(shù)值分類和自動化鑒定61.1.3化學分類鑒定法6分子遺傳學分類鑒定法61.2細菌分類鑒定方法的前景6細菌的鑒定方法的介紹與總結(jié)71、細菌常規(guī)鑒定方法71. 1 免疫診斷技術(shù)71. 1. 1 凝集試驗71. 1. 2 免疫酶技術(shù)71.1. 3 免疫熒光技術(shù)71. 1. 4 放射免疫測定技術(shù)71. 1. 5 免疫膠體金標記技術(shù)71. 2 蛋白質(zhì)圖譜分析72、細菌的數(shù)值分類和自動化鑒定83、化學分類鑒定法83.1 磷脂脂肪酸分析技術(shù)PLFA6832 高

2、效液相色譜HPLC783.3 氣相色譜GC784、分子遺傳學分類鑒定法94. 1 細菌染色體DNA G+ C mol %含量測定94. 2 核酸雜交技術(shù)94. 3 限制性核酸內(nèi)切酶分析法94. 4 質(zhì)粒圖譜分析法94. 5 脈沖場凝膠電泳分析法94. 6 PCR技術(shù)94. 7 16SrRNA 序列和16S23SrRNA 間區(qū)序列分析法104. 8 微生物全基因組測序106、參考文獻10細菌分類鑒定方法的研究進展摘 要細菌分類鑒定方法包括表型鑒定法和分子遺傳學鑒定法兩大類,分成4個水平:細菌形態(tài)和生理生化水平、細胞組分水平、蛋白質(zhì)水平和核酸水平。表型鑒定法是對前3個水平的鑒定,包括常規(guī)鑒定法、數(shù)

3、值分類鑒定法和化學分類鑒定法。分子遺傳學鑒定法1是核酸水平的鑒定,對細菌染色體或質(zhì)粒DNA 進展分析,核酸雜交、PCR 技術(shù)、16SrRNA 和16 23SrRNA 序列分析、全基因組測序等,此類方法使細菌種屬定位和親源關(guān)系判別由表型特征深化為基因型鑒定。本文主要來介紹各種分類方法以及每種方法的優(yōu)缺點。關(guān)鍵詞：細菌分類鑒定 表型鑒定 分子遺傳學鑒定Bacterial classification and identification of the research progressABSTRATCBacterial classification and identification metho

4、d two categories, including the the phenotype identification method and molecular genetic identification method is divided into four levels: the bacterial morphological and physiological and biochemical level, the level of cellular components, protein level and the nucleotide level. The phenotypic i

5、dentification law is the identification of the first three levels, including conventional identification method, numerical classification and identification and chemical classification identification method. Identification of molecular genetics method 1 is the identification of the nucleic acid leve

6、l, analysis of the bacterial chromosome or plasmid DNA, nucleic acid hybridization, PCR, 16SrRNA and the 16 23SrRNA sequence analysis of whole-genome sequencing, such positioning method bacterial species and phylogenetic discrimination by the deepening of the phenotypic characteristics of genotyping

7、. This paper is mainly to introduce the various classification methods as well as the advantages and disadvantages of each method.Key word ：Bacterial classification and identification Phenotypic identification Molecular genetic identification1、引言1.1細菌分類鑒定1.1.1 細菌常規(guī)鑒定方法細菌常規(guī)鑒定法是細菌形態(tài)和生理生化水平及蛋白質(zhì)水平的鑒定,前者

8、是最經(jīng)典、最常用的分類鑒定指標,也是現(xiàn)代化分類鑒定的依據(jù),后者包括免疫診斷技術(shù)、蛋白質(zhì)圖譜分析和氨基酸序列分析等。細菌的數(shù)值分類和自動化鑒定目前應(yīng)用較多的自動化鑒定系統(tǒng)主要有:Vitek - AMS(Automated Microbic System) 2 、Biolog、MicroScan 、Entero2tube 、MIDI、Sensititte 、Autosceptor 、Crystal 等鑒定系統(tǒng)。數(shù)值分類法是近20 年來開展起來的細菌分類理論,它應(yīng)用大量菌對相關(guān)生化試驗反響出現(xiàn)的頻率得出數(shù)據(jù)進展分析,優(yōu)化組合數(shù)10 項生理生化指標集合成套試劑,根據(jù)相似系數(shù)大小判斷細菌種屬間的親源性。

9、自動化微生物鑒定系統(tǒng)即采用數(shù)值分類原理。微生物數(shù)值分類鑒定集數(shù)學、電子、信息及自動分析技術(shù)于一體,具有系統(tǒng)化、標準化、微量化和簡易化等優(yōu)點,采用商品化的鑒定測試卡,將未知菌鑒定到屬、種、亞種或生物型,可不同來源的臨床標本進展針對性鑒定,所得結(jié)果以數(shù)字方式表達,與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)(手冊或軟件) 比照得出鑒定結(jié)果?；瘜W分類鑒定法20 世紀50 年代中期由Cummins 和Harris 建立起來的化學分類鑒定法3主要通過細菌細胞壁化學成分即氨基酸和糖的分析進展分類鑒定,屬的分類主要測定各種氨基酸組分,種的鑒定主要是對糖的分析。另外,還有全細胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸類脂成分分析、枝菌酸分析、醌類分

10、析和光合色素成分分析等,常使用紅外光譜、氣相色譜、高效液相色譜和質(zhì)譜等新技術(shù)。分子遺傳學分類鑒定法分子遺傳學分類法是以微生物的遺傳型基因型特征為依據(jù)，判斷微生物間的親緣關(guān)系，排列出一個個的分類群。目前較常使用的方法有：細菌染色體DNA G+ C mol %含量測定、核酸雜交技術(shù)、限制性核酸內(nèi)切酶分析法、質(zhì)粒圖譜分析法、脈沖場凝膠電泳分析法、PCR技術(shù)、16SrRNA 序列和16S23SrRNA 間區(qū)序列分析法、微生物全基因組測序1.2細菌分類鑒定方法的前景每種鑒定方法均有其優(yōu)點和缺陷,常規(guī)鑒定法常出現(xiàn)表型表達不穩(wěn)定、敏感性不高、測試工程多、費時費力等問題;免疫診斷技術(shù)假設(shè)無相應(yīng)抗體那么無法鑒定

11、;細菌自動化鑒定適于快速鑒定,但目前數(shù)據(jù)庫中模式菌種數(shù)量有限,局部細菌只能鑒定至屬,對革蘭氏陽性菌和厭氧菌的鑒定效果較差;分子遺傳學鑒定是從本質(zhì)上說明細菌間的親源關(guān)系,但所需試劑和儀器昂貴,鑒定時間較長,專業(yè)性強,適于科研上的細菌分類研究,不適于基層和臨床微生物的快速鑒定。因此,細菌分類鑒定必須同時使用幾種方法或系統(tǒng)全面鑒定,表型鑒定和分子遺傳學鑒定結(jié)合可對未知菌進展準確合理定位,目前應(yīng)充分利用和完善現(xiàn)有鑒定技術(shù),繼續(xù)積累核酸數(shù)據(jù)庫資源,研究和推廣新的分子遺傳學鑒定法,使其在敏感性、特異性和實用性上更適合細菌快速準確鑒定的需要,使其發(fā)揮應(yīng)有的和更大的作用。隨著細菌鑒定方法的不斷建立和完善,將為

12、科研和臨床工作者提供簡便、快速、準確、微量、靈敏和本錢低廉的檢測方法和更先進、更全面的檢測手段。細菌的鑒定方法的介紹與總結(jié)1、細菌常規(guī)鑒定方法1. 1 免疫診斷技術(shù)1. 1. 1 凝集試驗?zāi)壳俺Ｓ玫氖瞧咸亚蚓鷧f(xié)同凝集試驗(SPA - CoA) ,金黃色葡萄球菌細胞壁的A 蛋白(SPA) 能與動物血清中IgG的Fc 結(jié)合,成為致敏的顆粒載體,特異性IgG的Fc 與SPA 結(jié)合后, F ( ab) 2 段暴露在葡萄球菌外表,與相應(yīng)細菌反響呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象,此法用于細菌快速鑒定和分型。1. 1. 2 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)( EIA , Enzymeimmunoa2ssay) 是將酶標記的抗抗體與抗原抗體

13、復(fù)合物結(jié)合形成抗原- 抗體- 酶標記抗抗體復(fù)合物,參加酶底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物。以酶聯(lián)免疫吸附測定( ELISA) 和斑點酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(Dot - ELISA) 應(yīng)用較廣泛。1.1. 3 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)( FIA , Fuorescenceimmunoassay) 是將一抗滴加于待檢抗原上,再加一抗的熒光抗體(二抗) ,呈現(xiàn)特異性的熒光抗原抗體復(fù)合物以鑒定病原菌。此法比ELISA 更直觀,可直接觀察到菌體形態(tài)。1. 1. 4 放射免疫測定技術(shù)放射免疫測定( RIA , Rad2ioimmunoassay) 是用放射性同位素標記抗原或抗體,與相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合后通過放射自顯影定性和定量

14、抗原或抗體。1. 1. 5 免疫膠體金標記技術(shù)膠體金是繼酶、熒光素和放射同位素后免疫標記技術(shù)中令人矚目的新標記物。膠體金是氯金酸(HAuCl4) 在復(fù)原劑如白磷、枸櫞酸鈉等的作用下,聚合成特定大小的金顆粒,通過靜電作用與抗體或抗原形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài),即為免疫金,免疫金與相應(yīng)的抗原抗體結(jié)合后,呈現(xiàn)特定的顏色反響。1. 2 蛋白質(zhì)圖譜分析蛋白質(zhì)圖譜分析主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳( PAGE ,Polyacrylamide Gel Electrophoresis)和SDS - PAGE。聚丙烯酰胺凝膠是單體丙烯酰胺(Acr) 和N ,N- 亞甲雙丙烯酰胺(Bis) 在催化劑過硫酸銨和加速劑四甲基

15、乙二胺(TEMED) 作用下聚合為含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈,相鄰長鏈通過甲叉橋連接形成三維網(wǎng)狀構(gòu)造物質(zhì),PAGE 根據(jù)電荷、形狀和分子大小別離和定性、定量分析蛋白質(zhì)和多肽。SDS - PAGE 根據(jù)分子量的不同別離蛋白質(zhì),SDS 是一種陰離子外表活性劑,與蛋白質(zhì)疏水局部結(jié)合使蛋白質(zhì)帶大量負電荷且使蛋白質(zhì)的形狀趨向一致,抵消了蛋白質(zhì)本身所帶電荷和形狀的影響,因此,樣品分子量的對數(shù)與其在凝膠中的遷移率呈直線關(guān)系。2、細菌的數(shù)值分類和自動化鑒定法國生物- 梅里埃(Bio - Merieux) 公司的Vitek - AMS系統(tǒng)是應(yīng)用最普遍的細菌自動化鑒定系統(tǒng)之一,品種齊全,鑒定范圍廣,可鑒定18 00

16、0 多種細菌。它的系列主要有Vitek30 、Vitek60 、Vitek120及半自動鑒定儀ATB expression4全自動鑒定是從接種、培養(yǎng)、讀數(shù)到報告的全過程自動完成,利用負壓將菌液參加測試卡各孔,封口機封口,置孵箱孵育,閱讀器以665 nm 波長每小時將測試卡拉出1 次對各孔底物進展光掃描,動態(tài)觀察其變化,計算機將判讀結(jié)果與標準數(shù)據(jù)庫比較得出鑒定結(jié)果。ATB expression 細菌鑒定系統(tǒng)包括ATB 光電比濁儀、ATB 接種器、ATB 閱讀器、ID 32E 測試卡、計算機與打印機6 局部,用于腸桿菌科及其他革蘭氏陰性菌的鑒定。此系統(tǒng)配制菌液和接種測試卡由人工完成,結(jié)果由閱讀器和

17、計算機模式株數(shù)據(jù)庫判讀,測試卡的32 項生化試驗形成11 位數(shù)的生物編碼,與標準數(shù)據(jù)庫比較得出細菌的鑒定概率%id 和模式頻率T 值。該系統(tǒng)可在424 h 鑒定600多種細菌,操作簡便、結(jié)果準確,適用于醫(yī)院及科研單位。“Biolog細菌鑒定系統(tǒng)5由不同氧化復(fù)原指示劑和發(fā)酵性碳源的培養(yǎng)基干粉組成96 孔細菌培養(yǎng)板。將待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物配制成適當濃度的菌懸液,由多頭接種器快速完成96 孔接種,37 培養(yǎng)424 h ,置檢察室的分光光度計中檢測,計算機自動分析該菌的“指紋圖譜得出鑒定結(jié)果。此系統(tǒng)適用于動植物檢疫,醫(yī)學臨床檢驗及食品、飲水衛(wèi)生的監(jiān)控等。MicroScan 細菌鑒定系統(tǒng)包括全自動系列W

18、alkway 40 、Walkway 96 和半自動系列AutoScan - 4 。全自動Walkway系列采用RENOK真空接種器接種菌懸液,一次完成96 孔接種,自動孵育、自動判讀結(jié)果。此系統(tǒng)可鑒定近500 種細菌,為臨床診斷和院內(nèi)感染控制提供了良好途徑。3、化學分類鑒定法3.1 磷脂脂肪酸分析技術(shù)PLFA6磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid, PLFA)分析技術(shù)是基于不同物種PLFA 的不同而進展的分析技術(shù)。PLFAs 的提取,鑒定和定量分析可以提供水環(huán)境中總的生物群體的有關(guān)信息。群體中生物的大體代謝地位和此群體的應(yīng)力也可以表現(xiàn)出來。對樣品中磷脂脂肪酸的常規(guī)分析可

19、以與放射標記的特定菌種結(jié)合起來應(yīng)用，再對放射性的PLFAs 進展分析。此技術(shù)提取了微生物放射性標記的指紋圖譜。它可用于研究生物群落中代謝選擇的自然生物和非生命物質(zhì)的混合物。目前PLFA 技術(shù)還不能很好地對微生物群落進展準確分類，因為一些微生物也可能含有差異不大的PLFA，這成為應(yīng)用此技術(shù)的一大障礙。32 高效液相色譜HPLC7應(yīng)用于放線菌的分子鑒定和細胞化學成分分析可直接測定菌株DNA 的堿基組成和甲基萘醌型,為菌種的分類鑒定提供有利的證據(jù)。3.3 氣相色譜GC7應(yīng)用于放線菌的鑒定，可直接測定菌株主要脂肪酸的組成及含量，該分析是化學鑒定中重要的指標之一。4、分子遺傳學分類鑒定法4. 1 細菌染

20、色體DNA G+ C mol %含量測定細菌染色體DNA G+ C mol %含量測定對表型相似的疑難菌株鑒定、新的分類單位建立和細菌親源關(guān)系判定等是一項重要的分類鑒定指標和參考標準,包括紙層析法、浮力密度法、高效液相色譜法8 、熱變性溫度(Tm) 9法和熒光法等。4. 2 核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)10,11根據(jù)堿基互補配對原理,將2 條不同來源的單鏈核酸進展復(fù)性以鑒定菌株間的親源關(guān)系,用于DNA - DNA(Southern 雜交) 、DNA -RNA、RNA - RNA(Northern 雜交) 和PNA - DNA 雜交( PNA為肽核酸) 。DNA - DNA 雜交適用于種水平的研究,

21、 而DNA - rRNA 雜交用于屬和屬以上水平的分類研究。核酸雜交目前常采用固相雜交法,將待測菌株雙鏈核酸解成單鏈固定在硝酸纖維素濾膜等固相支持物上,置入含有經(jīng)同位素標記、酶切并解鏈的參照菌株的單鏈核酸( 探針) 液中復(fù)性,形成新的雙鏈核酸,測定雜合雙鏈的相對放射性強度來確定菌株間的同源性程度。一般認為核酸雜交同源性小于20 %為不同菌屬,20 %60 %為屬內(nèi)嚴密相關(guān)的種,60 %70 %為同種內(nèi)不同亞種,大于70 %為同一亞種。另外,對線粒體DNA(mtDNA) 進展雜交分析將對種內(nèi)和種間的分類更加靈敏。4. 3 限制性核酸內(nèi)切酶分析法限制性核酸內(nèi)切酶分析法(REA ,Restricti

22、on Enzyme Analysis) 是用限制性內(nèi)切酶消化不同細菌染色體DNA 產(chǎn)生不同長度限制性片段的酶切圖譜,將圖譜與菌進展比較鑒定細菌。4. 4 質(zhì)粒圖譜分析法質(zhì)粒是獨立于細菌染色體之外進展復(fù)制的輔助性遺傳單位,不是細菌生長繁殖所必需的,但質(zhì)?？墒顾拗骶哂心承┓侨旧w決定的生物學性狀如耐藥性、溶血性、細菌毒力等。質(zhì)粒圖譜分析( PP分析,Plasmid Profile Analysis) 是通過比較電泳圖譜上質(zhì)粒DNA 數(shù)目和分子量分析細菌,該法特異性好、分析周期短、穩(wěn)定可靠,幾乎適用于所有細菌的分型,特別適用于尚未建立標準分型方法和缺乏血清型的菌屬(種) 的鑒定和分型。4. 5 脈

23、沖場凝膠電泳分析法脈沖場凝膠電泳分析法12(PFGE ,Pulsed - field Gel Electrophoresis) 采用定時改變電場方向的交變電源,每次電流方向改變后持續(xù)15 s 再改變電流方向,如此反復(fù)循環(huán)。PFGE 運用罕見切點的內(nèi)切酶切割染色體DNA ,產(chǎn)生10800 kb 長的520 條大的DNA 片段。PFGE 是目前分辨力最高的分型方法之一,但技術(shù)要求高。4. 6 PCR技術(shù)PCR 技術(shù)是在模板、引物和4 種脫氧核苷酸存在的條件下依賴DNA 聚合酶的酶促反響,包括高溫變性、低溫復(fù)性和中溫延伸3 個階段,經(jīng)2530 個循環(huán),原始模板可擴增106 以上。PCR 技術(shù)具有高度

24、的特異性和敏感性,是臨床微生物檢驗的理想工具,用于細菌和病毒感染的早期診斷、遺傳性疾病的診斷、腫瘤基因分析和法醫(yī)學診斷等, 現(xiàn)已衍生出多種PCR 技術(shù), 如: 錨定PCR、反向PCR、多重PCR、原位PCR、不對稱PCR、重復(fù)序列PCR、巢式PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、差異顯示PCR、免疫PCR、PCR - ELISA、隨機擴增DNA 多態(tài)性分析(RAPD) 和擴增片段長度多態(tài)性(AFLP) 等。RAPD 又稱為隨機引物PCR 法(AP - PCR) ,可用于未知菌株的快速鑒定和流行病學調(diào)查,細菌種間、亞種間乃至株間的親緣關(guān)系分析。AFLP 技術(shù)1995 年由Vos 等首次報道,用于各種大小的基因組

25、指紋分析,為研究物種間尤其是原核生物屬以下及株間的親緣關(guān)系提供有效手段。4. 7 16SrRNA 序列和16S23SrRNA 間區(qū)序列分析法rRNA 是研究細菌進化和親源關(guān)系的重要指標,含量大(約占細菌RNA 總量80 %) ,素有“細菌化石之稱,是細菌系統(tǒng)分類學最有用和常用的分子鐘。原核生物的5SrRNA、16SrRNA 和23SrRNA 位于同一操縱子上, 其中16SrRNA 為細胞所共有,分子大小適合操作,其功能同源且最為古老,既含保守序列又含可變序列。保守性反映生物物種的親源關(guān)系,為系統(tǒng)發(fā)育提供線索;高變性那么提醒生物物種的特征核酸序列,是種屬鑒定的分子根底,其序列變化與進化距離相對應(yīng)

26、,在細菌種屬分類鑒定中廣泛應(yīng)用。16SrRNA13序列分析是一種非培養(yǎng)分析技術(shù),能快速鑒定目前尚不能人工培養(yǎng)的微生物。假設(shè)兩菌的16SrRNA 同源性大于99 % , 且染色體DNA 雜交率大于70 % ,基因水平上為同一種細菌。16S23SrRNA 間區(qū)14 ( ISR , Intergenic Spacer Region)近幾年來在細菌分類鑒定中倍受關(guān)注,已成為新熱點。16S23SrRNA 的ISR 序列作為16SrRNA 序列系統(tǒng)分類的一個有力補充,可根據(jù)細菌間ISR 的數(shù)目、長度、種類和序列的不同進展分類。16S23SrRNA 的ISR 序列作為細菌分類新的目標基因具有屬、種、型、株的

27、特異性與靈敏性,ISR 作為細菌分類鑒定的研究熱點,將具有無可比較的優(yōu)越性,為細菌系統(tǒng)發(fā)育學帶來新的飛躍。4. 8 微生物全基因組測序微生物全基因組測序15 是當前國際生命科學領(lǐng)域中掌握微生物全部遺傳信息的最正確途徑。1990 年10 月1 日人類基因組方案(HGP ,HumanGenome Project) 的正式啟動極大地推動了微生物基因組學和微生物蛋白質(zhì)組學的飛速開展,1995 年7 月首次報道了流感嗜血桿菌的全基因組序列(1. 8 Mb) ,至今已正式公布的微生物基因組序列有53 種,正在進展的至少有100余種,由此迎來了“后基因組生物學時代。5、完畢語每種鑒定方法都有各自的適用范圍及

28、優(yōu)缺點，我們應(yīng)充分利用和完善現(xiàn)有鑒定技術(shù),繼續(xù)積累核酸數(shù)據(jù)庫資源,研究和推廣新的分子遺傳學鑒定法,使其在敏感性、特異性和實用性上更適合細菌快速準確鑒定的需要,使其發(fā)揮應(yīng)有的和更大的作用。隨著細菌鑒定方法的不斷建立和完善,將為科研和臨床工作者提供簡便、快速、準確、微量、靈敏和本錢低廉的檢測方法和更先進、更全面的檢測手段。6、參考文獻1 焦振泉,劉秀梅. 細菌分類鑒定的分子生物學方法研究進展J . 國外醫(yī)學:衛(wèi)生學分冊,1996 ,(6) :356 - 361.2 閻東輝,許淑珍,馬紀平,等. VITEK- AMS 在臨床細菌鑒定中的應(yīng)用J . 中華實用醫(yī)學,2000 ,(10) :9 - 10.

29、3 姜遠良. 化學分類法在細菌和真菌系統(tǒng)分類中的應(yīng)用和開展J . 遼寧師范大學學報(自然科學版) ,1995 ,(2) :152 - 155.4 Roger F ,Roger A. Evaluation of the ATB 32 E systemfor automated identifica2tion of EnterobacteriaceaeJ . Pathol Biol ,1992 , (1) :78 - 80.5 Holmes B ,Costas M,Ganner M,et al. Evaluation of biolog systemfor identifica2tion of s

30、ome gram- negative bacteria of clinical importanceJ. J Clin Microbi2ol ,1994 , (8) :1 970 - 1 975.6 曲直,阮繼生. 高效液相色譜和氣相色譜在放線菌分類鑒定中的應(yīng)用R. 曲直 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所,阮繼生 ,中國科學院微生物研究所.7 王巨存,趙鳳儀. 高效液相色譜法分析分枝菌酸鑒定分枝桿菌.天津醫(yī)院中心試驗室R. 2005.8 銀燕,黃愛娣. 用高效液相色譜法進展G+ C 的測定J . 中國微生物學雜志,2002 ,(2) :112 - 113.Environ Microbiol ,2002 , (11) :770 - 773. 9 Gonzalez J M,Saiz - Jimenez C.Afluorimetric method for the estimation of G+Cmol % content in microorganisms by thermal denaturation temperature J.10黃立南,聶湘平,藍崇鈺. 核酸雜交技術(shù)在微生物生態(tài)學上的應(yīng)用J .生態(tài)科學,2001 ,(1