流式細(xì)胞儀原理及操作步驟

1、流式細(xì)胞儀原理及操作步騾流或細(xì)胞儀（FCM）是八十年代臬單克隆抗體.熒光化學(xué)*激光.計(jì)算機(jī)等鳶技術(shù)發(fā)展趁 來的一科先扯儀黑,己廣汪應(yīng)用于免疫舉生楊化哮，生物學(xué)，腫痛學(xué)以及血液學(xué)等方面的研 克和臨床常規(guī)工作。其中檢測(cè)人自細(xì)胞表面標(biāo)志可對(duì)自血病、淋巴癇作用辿速正確的診新，對(duì) 淋巴細(xì)胞群和亞群進(jìn)行赫確分類，還能分禽純化某一群或亞群細(xì)胞?；罴?xì)胞免疫吳光技忒 是用 于FCM檢測(cè)的標(biāo)本準(zhǔn)備染色后也能農(nóng)變光顯微鏡下遺行觀寨，在禁些婆唸條件下2活細(xì)胞免疫炎光染色后的特畀性和軟感性要優(yōu)于痛片圍定的常規(guī)間揍免疫炎光的結(jié)果?；罴?xì)胞表面保翱有較完整的抗原或受體,先用將畀性亂嫄性單充隆抗體與細(xì)胞表面相底抗原結(jié)合，再用熒

2、光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測(cè)定的熒光強(qiáng)度和陽性百分率即可知相應(yīng) 抗原 的密嵐和分布。（二）操作步驟制備活性需的細(xì)胞懸液（培養(yǎng)細(xì)胞糸外周血單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均 可用于本法？1用10% FCSRPMI1640調(diào) 整細(xì)胞滾度為5x10 6 1 x 10 7 Z ml取40卩1細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特畀性Me Ab （5：50卩1的小玻璃管或塑料離養(yǎng)管,再加50卩11 : 20 （用DPBS 稀釋）天箔正常兔血淸30mirj用洗滌液洗滌2決，每次加洗滌液2ml左右1000rpmx5min春上請(qǐng)卩加入50pl工作濃度的羊抗亂或免抗亂）熒光標(biāo)記賜，龍分振揺4 4乜30min用洗濟(jì)液冼滌2次，每次

3、如液2ml，左右1000rpmx5min加適董固老液如為FCM制務(wù)標(biāo)本,般如入1mlg走液,如制片后在炭光顯微銃下觀癱,視細(xì)胞冰度加入100500plJFCM檢測(cè)或制片后灸光顯微銃下觀案（標(biāo)本農(nóng)試管中C三）述利和爰材1 各種特畀性單克隆抗體。2. 吳光標(biāo)記的羊抗亀或兔抗亂第二抗體，夭話正常兔血請(qǐng)。3.10% FCS RPMI1640, DPBS .洗滌毅定液4. 玻璃管塑料管厲離心機(jī)，熒光顯微鏡等。（b）注憲爭(zhēng)項(xiàng)1 整個(gè)操作強(qiáng)4C下進(jìn)行孑詵滌浚中加有比帶規(guī)防崗利量需10信的N aN3,上逍賣驗(yàn) : * : *條件是馬止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生靈朕.脫第&2. 洗滌要尢分，紅外碳硫儀以避免游再抗體封岡二抗與細(xì)胞膜上一擾相結(jié)合，出現(xiàn)假m 性3. 加適量正常兔血請(qǐng)可封聞某些細(xì)胞表面免痩球餐令Fc受體，睜低和防止非精畀性 染 色。4. 細(xì)胞活性要好，公則易發(fā)生非特界性茨光爭(zhēng)色。itT 1. DPBS C x10$ 眶存液）NaCI 80gKCI 2g蒸錦水加至1000mlNa2 HPO4 1L5g臨用時(shí)用熬鐳水1 ；J0解猝KH2 PO4 2g2. 洗滌液DPBS 900mlFCS 50inL 終垠度 5% ?4% NaN 3 50ml （終戒度 0.2 %）走液DPBS1000ml葡萄瘡20g （終濃度甲醴10mlNaN 30.2g （終