血液制品去除滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則

1、血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則目前已知經(jīng)血液制品傳染的病毒主要有HBVHCVHIV-1、HIV-2、HTLV和細(xì)小病毒B19。尚未發(fā)現(xiàn)經(jīng)血液制品傳染CJD）但有少數(shù)研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)性傳染現(xiàn)象，因此要密切關(guān)注CJD,特另1J是vCJD的發(fā)展動(dòng)向。為了提高血液制品安全性，生產(chǎn)工藝要具有一定的去除/滅活部分病毒能力，生產(chǎn)過程中應(yīng)有特定的去除/滅活病毒方法。本技術(shù)指導(dǎo)原則是對(duì)血液制品（指以人血漿為原料制備的制品）生產(chǎn)過程以及特定的去除/滅活病毒方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則，包括指示病毒和病毒去除/滅活方法的選擇、驗(yàn)證方案的設(shè)計(jì)、結(jié)果判定以及附錄所列技術(shù)驗(yàn)證申報(bào)的程序。一、去除/滅活病毒方法的選擇

2、由于不同類血液制品潛在的污染病毒的可能性不同，為此選擇病毒去除/滅活方法的側(cè)重點(diǎn)也應(yīng)有所不同：（一）凝血因子類制品生產(chǎn)過程中應(yīng)有特定的能去除/滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一種或多種方法聯(lián)合去除/滅活病毒。（二）免疫球蛋白類制品對(duì)于免疫球蛋白類制品（包括靜脈注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特異性人免疫球蛋白）生產(chǎn)過程中應(yīng)有特定的滅活脂包膜病毒方法。但從進(jìn)一步提高這類制品安全性考慮，提倡生產(chǎn)過程中加入特定的針對(duì)非脂包膜病毒的去除/滅活方法。（三）白蛋白采用低溫乙醇生產(chǎn)工藝和特定的去除/滅活病毒方法，如巴斯德消毒法等。二、常用的去除/滅活病毒方法評(píng)價(jià)（一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）1 .

3、人血白蛋白制品幾十年臨床應(yīng)用結(jié)果表明，白蛋白的巴氏消毒法對(duì)HIV和肝炎病毒是安全的。其病毒滅活條件已很完善，可不要求進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證。但是必須對(duì)巴氏消毒法所用設(shè)施進(jìn)行驗(yàn)證，使巴氏消毒各參數(shù)符合要求（包括制品內(nèi)溫度分布的均一性和滅活時(shí)間）。2 .其它血液制品（液體制劑）由于制品的組成、穩(wěn)定劑（如：氨基酸、糖、枸檬酸鹽等）及其濃度的不同，均會(huì)對(duì)滅活病毒效果有一定的影響。因此在采用巴氏消毒滅活病毒方法時(shí)必須進(jìn)行病毒滅活效果驗(yàn)證。（二）干熱法（凍干制品）80c加熱72小時(shí)，可以滅活HBVHCVHIV和AV等病毒。但應(yīng)考慮制品的水分含量、制品組成（如：蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸）對(duì)病毒滅活效果的影響。應(yīng)確定

4、允許的制品瓶間各參數(shù)的差異。病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗(yàn)證一次。驗(yàn)證時(shí)干燥箱內(nèi)應(yīng)設(shè)多個(gè)測(cè)溫點(diǎn)（包括制品內(nèi)、箱內(nèi)最tWj和最低溫度點(diǎn)）。（三）有機(jī)溶劑/去污劑（S/D）處理法有機(jī)溶劑，如：磷酸三丁脂（TNBP和非離子化的去污劑，如：ritonX-100或吐溫-80結(jié)合可以滅活脂包膜病毒，但對(duì)非脂包膜病毒無效。常用的滅活條件是0.3%TNBP和1%土溫-80,在24c處理至少6小時(shí)；0.3%TNB可口1%ritonX-100,在24c處理至少4小時(shí)。S/D處理前應(yīng)先用1科m濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒（顆?？赡懿啬洳《緩亩绊懖《緶缁钚Ч?。加入S/D后應(yīng)確保是均一的混合物。在滅活病毒全過程

5、中應(yīng)將溫度控制在規(guī)定的范圍內(nèi)。如果在加入S/D后過濾，則須檢測(cè)過濾后S/D的濃度是否發(fā)生變化，如有變化應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。吐溫-80應(yīng)采用植物源性，并應(yīng)采用稱量法量取。（四）膜過濾法膜過濾技術(shù)只有在濾膜的孔徑比病毒有效直徑小時(shí)才能有效除去病毒。該方法不能單獨(dú)使用，應(yīng)與其它方法聯(lián)合使用。驗(yàn)證研究時(shí)應(yīng)考慮蛋白溶液的濃度、濾速、壓力和過濾量等重要參數(shù)。在過濾前及過濾后應(yīng)測(cè)試濾膜的完整性。（五）低pH孵放法研究表明，免疫球蛋白生產(chǎn)工藝中的低pH（如pH=4）處理（有時(shí)加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。滅活條件（如：pH值、孵放時(shí)間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素）可能影響病毒滅活效果，驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)該

6、研究這些參數(shù)允許變化的幅度。三、特定的去除/滅活病毒方法驗(yàn)證（一）指示病毒的選擇首先，應(yīng)該選擇經(jīng)血液傳播的相關(guān)病毒（如：HIV）,不能用相關(guān)病毒的，要選擇與其理化性質(zhì)盡可能相似的指示病毒；第二，所選擇的病毒理化性質(zhì)應(yīng)有代表性（病毒大小、核酸類型以及有無包膜），其中至少應(yīng)包括一種對(duì)物理和/或化學(xué)處理有明顯抗性的病毒。在進(jìn)行去除/滅活病毒驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)根據(jù)制品的特性及所采用的病毒去除/滅活工藝，參照下表列舉的病毒選擇適宜的指示病毒。所選擇的指示病毒至少應(yīng)包括HIV-1、HBV和HCV莫擬病毒以及非脂包膜病毒。水皰性口炎病毒（VSV耐受的p范圍比較廣，驗(yàn)證低p孵放法滅活病毒效果時(shí)可選用此指示病毒。經(jīng)血液

7、傳播疾病的相關(guān)病毒及驗(yàn)證可選用的指示病毒（舉例）病毒基因組脂包膜大?。╪m）指示病毒舉例HIVRNA有80-100HBVDNA有45鴨乙型肝炎病毒、偽狂犬病毒HCVRNA有40-60牛腹瀉病毒、Sindbis病毒HAVRNA無27HAV脊髓灰質(zhì)炎病毒、腦心肌炎（EMC病毒B19DNA無20犬細(xì)小病毒、豬細(xì)小病毒（二）方案設(shè)計(jì)1 .去除/滅活病毒驗(yàn)證研究應(yīng)符合GLP的要求。2 .研究影響去除/滅活病毒效果的參數(shù)（包括機(jī)械參數(shù)和理化參數(shù)）允許變化的幅度。3 .研究病毒滅活動(dòng)力學(xué)，包括病毒滅活速率和滅活曲線。4 .指示病毒滴度應(yīng)該盡可能高（病毒滴度應(yīng)106/ml）。5 .加入的病毒與待驗(yàn)證樣品體積比

8、不能高于1：9。不做進(jìn)一步處理（如6 .如可能，驗(yàn)證過程中每步取出的樣品應(yīng)盡快直接進(jìn)行病毒滴定,超離心、透析或保存、除去抑制劑或毒性物質(zhì)等）。如果樣品必須做進(jìn)一步處理，或不同時(shí)間取出的樣品要在同一時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)考慮這些處理方法對(duì)病毒檢測(cè)結(jié)果的影響。7 .檢測(cè)方法可包括蝕斑形成、細(xì)胞病變（如合胞體或病灶形成）、終點(diǎn)滴定或其他方法。這些方法應(yīng)該有適宜的靈敏度和可重復(fù)性，每一個(gè)取樣點(diǎn)應(yīng)取雙份樣品并設(shè)有對(duì)照以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。8 .如果制品的生產(chǎn)工藝中包含了兩步或兩步以上病毒去除/滅活方法，應(yīng)該分別進(jìn)行病毒滅活效果驗(yàn)證。（三）觀察指標(biāo)1 .病毒方面（1）去除/滅活病毒滴度；（2）滅活病毒速率、滅活曲

9、線。以列表和做圖形式報(bào)告驗(yàn)證結(jié)果。2 .病毒去除/滅活各參數(shù)允許變化范圍3 .蛋白質(zhì)方面（1）制品質(zhì)量應(yīng)符合中國生物制品規(guī)程或有關(guān)規(guī)定；（2）采用適當(dāng)方法測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能活性的變化。如：制品比活性、HIVIG的Fc功能分析可了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生了變化；凝膠色譜法可檢測(cè)蛋白質(zhì)分子大小和形狀的變化；蛋白質(zhì)形狀變化可導(dǎo)致擴(kuò)散系數(shù)、沉降常數(shù)和粘度的改變；SDS-PAGE特別是等電聚焦和PAGE吉合（雙向電泳）也是檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的很好方法。（3）如果采用新的去除/滅活方法（包括更換使用已認(rèn)可的病毒滅活方法或國內(nèi)外未曾采用過的病毒去除/滅活方法），需對(duì)蛋白質(zhì)半衰期和新免疫原性進(jìn)行研究。要求如下：

10、半衰期：用適宜動(dòng)物（如大鼠或家兔）和未經(jīng)病毒去除/滅活的相同制品進(jìn)行半衰期比較；新免疫原性：新免疫原性用來檢查蛋白質(zhì)較高級(jí)別結(jié)構(gòu)上的變化。這些變化不一定損害蛋白質(zhì)功能，但是會(huì)引起受體免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)新免疫原性是非常困難的?？捎媒?jīng)和未經(jīng)病毒滅活的蛋白分別免疫動(dòng)物（如家兔），所產(chǎn)生的抗體交叉用未經(jīng)和經(jīng)病毒滅活的蛋白結(jié)合。如果經(jīng)病毒滅活的蛋白抗體被未經(jīng)病毒滅活的蛋白完全結(jié)合，說明不含新抗原。由于不能保證人類免疫系統(tǒng)識(shí)別的表位與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相同，因此推薦在IV期臨床（獲得生產(chǎn)文號(hào)后）開展是否有新抗原產(chǎn)生的研究。（四）效果的判定判斷病毒去除/滅活的有效性須綜合考慮，不能僅以病毒去除/滅活的量來確定。在確

11、定有效之前，必須考慮如下因素，審慎評(píng)價(jià)每次驗(yàn)證結(jié)果。1 .驗(yàn)證試驗(yàn)所選擇的病毒是否適宜，病毒驗(yàn)證的設(shè)計(jì)是否合理。2 .病毒降低量（log10）>4logs,表示該步驟去除/滅活病毒有效。如因檢測(cè)方法造成病毒降低量v4logs時(shí)，應(yīng)盲傳三代，如無病毒檢出，可認(rèn)定是有效的滅活病毒方法。3 .病毒滅活動(dòng)力學(xué)可更好的顯示病毒滅活的效果。病毒滅活通常不是簡單的一級(jí)反應(yīng)。往往是起始反應(yīng)速率快，其后變慢。如果病毒滅活速率隨時(shí)間明顯降低，表示該方法可能無效，或者殘留的指示病毒對(duì)該滅活方法有抵抗力，說明該步病毒滅活方法無效。4 .病毒實(shí)際滴度為基礎(chǔ)病毒，指示病毒與樣品1：9的比例混勻后零點(diǎn)取樣的病毒滴度，

12、通過與經(jīng)去除/滅活病毒后的測(cè)定的實(shí)際病毒殘留量的比較，作為該病毒去除/滅活方法（步驟）實(shí)際的滅活病毒的量。5 .病毒檢測(cè)敏感度的限值。舉例說明：（1）加入6logs病毒，剩余4logs病毒，可將去除/滅活病毒的log數(shù)計(jì)算在生產(chǎn)全過程中去除/滅活病毒總量之中，但是就此步（方法）去除/滅活病毒能力而言是無效的。（2）加入6logs病毒，但由于制品本身的細(xì)胞毒作用使得檢測(cè)靈敏度限值為4logs,僅證明除去2logs的病毒。在此種情況下需改變?cè)囼?yàn)設(shè)計(jì)重新進(jìn)行驗(yàn)證。（3）加入6logs病毒，但仍可測(cè)定2logs的剩余病毒，且清除病毒的量可重復(fù)出，并不受工藝的影響，應(yīng)認(rèn)為是有效的去除/滅活病毒的方法。2

13、logs（4）加入6logs病毒，之后未檢測(cè)出病毒。但是由于檢測(cè)靈敏度限值為僅能認(rèn)為大約清除或滅活了4logs病毒。事實(shí)上可能等于或大于4logs,因此應(yīng)判定此方法清除的病毒量R4logs。（5）病毒滅活動(dòng)力學(xué)是非常重要的觀察指標(biāo)。如巴氏消毒法（60C,10小時(shí)），如果病毒殘留量很快降到最低檢出限度值，說明此方法滅活病毒效果很好。如果病毒滅活速率緩慢，在滅活結(jié)束時(shí)才達(dá)到最低檢出限度值，不能認(rèn)為是一個(gè)有效的病毒滅活方法。這就是說，評(píng)價(jià)驗(yàn)證結(jié)果不能僅考慮病毒降低量，同時(shí)也要考慮病毒滅活動(dòng)力學(xué)。四、生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒能力的驗(yàn)證生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒能力驗(yàn)證參照特定的去除/滅活病毒方法驗(yàn)證的要求進(jìn)

14、行。需要特殊考慮的問題有以下幾方面：（一）只對(duì)可能有去除/滅活病毒作用的生產(chǎn)步驟進(jìn)行驗(yàn)證。（二）模擬的生產(chǎn)工藝各種參數(shù)應(yīng)盡可能與實(shí)際的生產(chǎn)工藝相一致，如p、溫度、蛋白質(zhì)和其他組成成分的濃度、反應(yīng)時(shí)間、層析柱的柱床高度及流速與床高的比例、洗脫圖譜及該步驟的生產(chǎn)效果（如產(chǎn)量、比活性、組成成分）。應(yīng)分析生產(chǎn)工藝中各種參數(shù)的偏差對(duì)病毒去除/滅活效果的影響。（三）生產(chǎn)各步驟對(duì)不同類型病毒去除/滅活的選擇性。（四）核酸擴(kuò)增技術(shù)（如PCR檢測(cè)病毒核酸的靈敏度比較高，但是該檢測(cè)技術(shù)最大的局限性是不能區(qū)別被滅活了還是未被滅活的病毒。因此該技術(shù)不能用于滅活病毒量的驗(yàn)證，只能用于生產(chǎn)過程中病毒去除量的驗(yàn)證。（五）通

15、常在生產(chǎn)過程中去除/滅活病毒量是可以計(jì)算在清除病毒總量中，但不能認(rèn)定是有效病毒去除步驟。因?yàn)樯a(chǎn)過程通常有一些變化，很難控制及驗(yàn)證，而且，病毒分配完全取決于病毒特異的理化性質(zhì)，這些理化性質(zhì)影響了病毒與凝膠介質(zhì)相互作用和沉淀的性質(zhì)。因此由于病毒表面特性的微小差異（如：糖基化），指示病毒與靶病毒分配形式可能完全不同。在實(shí)驗(yàn)室增殖的相關(guān)病毒可能在分配上與野生株不同。然而，如果病毒降低量可重所要的組份能可靠的與一般公復(fù)，如果影響病毒分配的各生產(chǎn)參數(shù)可以適當(dāng)?shù)卮_定和控制,認(rèn)的含病毒組份分開，就可以符合有效步驟的標(biāo)準(zhǔn)（即，認(rèn)為是有效去除/滅活病毒步驟）（六）驗(yàn)證的目的是為了確定生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒的能力，獲得生產(chǎn)全過程中估計(jì)去除/滅活病毒的總量。一般降低的總量是各步降低病毒量的總和。但是由于病毒驗(yàn)證的局限性，如分步驟中病毒降低