水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群地檢測(cè)

1、水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)(一) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1) 了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測(cè)定原理和測(cè)定意義。(2) 學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測(cè)方法。(二) 實(shí)驗(yàn)原理水是微生物廣泛分布的天然環(huán)境。各種天然水中常含有一定數(shù)量的微生物。水中微生物的主要來(lái)源有：水中的水生性微生物(如光合藻類)、來(lái)自土壤徑流、降雨的外來(lái)菌群和來(lái)自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來(lái)源于人和動(dòng)物的傳染性排泄物。水的微生物學(xué)的檢驗(yàn)，特別是腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌

2、群數(shù)每升中不超過(guò)3個(gè)，細(xì)菌總數(shù)每mL不超過(guò)100個(gè)。所謂細(xì)菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit,cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。所謂大腸菌群，是指在37C24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個(gè)屆內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屆、檸檬酸桿菌屆、克雷伯氏菌屆和腸桿菌屆。水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭

3、氧芽胞桿菌等多種細(xì)菌。這些細(xì)菌都可隨人畜排泄物進(jìn)入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量最多，所以，水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前，國(guó)際上已公認(rèn)大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對(duì)飲用水必須進(jìn)行大腸菌群的檢查。水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn)用于各種水樣的檢驗(yàn)，但操作繁瑣，需要時(shí)間長(zhǎng)。濾膜法僅適用于自來(lái)水和深井水，操作簡(jiǎn)單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。（三）實(shí)驗(yàn)器材（1）菌落總數(shù)的測(cè)定：1）培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水。2）器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平血，滅菌吸管，滅菌試管等。（

4、2）大腸菌群的測(cè)定；1）培養(yǎng)基： 乳糖膽鹽蛋白月東培養(yǎng)基：蛋白月東20g，豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g，乳糖10g,0.04%漠甲酚紫水溶液25mL，水1000mL,pH7.4。制法：將蛋白月東、膽鹽從乳糖溶于水中，校正pH,加入指示劑，分裝，每瓶50mL或每管5mL,，并倒置放入一個(gè)杜氏小管，115C滅菌15min。雙倍或三倍乳糖膽鹽蛋白月東培養(yǎng)基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。 伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白月東10g，乳糖10g,K2HP042g,2%伊紅水溶液20M1,0.65%美藍(lán)水溶液lOmL，瓊脂17g，水1000mL,pH7.1。制法：將蛋白月東、磷酸鹽和瓊脂溶于水中，校正pH后

5、分裝.121C滅菌15min備用。臨用時(shí)加入乳糖并熔化瓊脂，冷至50-55C,加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻,傾注平板。 乳糖發(fā)酵管：除不加膽鹽外.其余同乳糖膽鹽蛋白月東培養(yǎng)基。2）器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平血，滅菌吸管，滅菌試管等。（四）實(shí)驗(yàn)方法（1）水樣的采集：1）自來(lái)水：先將自來(lái)水龍頭用灑精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min,以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。2）池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕觥Ｈ绻荒茉?h內(nèi)檢測(cè)

6、的，需放入冰箱中保存0細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定：1）水樣稀釋及培養(yǎng)： 按無(wú)菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋：根據(jù)對(duì)水樣污染情況的估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度（飲用水如自來(lái)水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較活潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水一被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度），吸取1mL稀釋液于滅菌平血內(nèi)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)重復(fù)。 將熔化后保溫度45C的牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基倒平也，每皿約15mL,并趁熱轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。 待瓊脂凝固后，將平也倒置于37C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)241h后取出，計(jì)算平也內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1

7、mL水樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。2）計(jì)算方法：作平板計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。3）計(jì)數(shù)的報(bào)告： 平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布乂很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。 稀釋度的選擇：a. 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例1）。b.

8、 若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來(lái)決定。若其比值小于2,應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若比值大于2,則報(bào)告其中較小的數(shù)字（1例2、例3）。c. 若所有稀釋度的平均菌落均大于300,則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（1例4）。d. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小丁30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（1例5）。e. 若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小丁1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例6）。f. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表l例7）。 細(xì)菌總數(shù)的報(bào)告：細(xì)菌的菌落數(shù)在1

9、00以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大丁100時(shí)，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示，如表1報(bào)告方式一欄所小。（3）大腸菌群的測(cè)定（多林:酵法）：表1稀釋度的選擇及細(xì)菌數(shù)報(bào)告方式稀釋度及鑿落數(shù)兩稀釋鑿落總數(shù)/（cfu/g報(bào)告月式（菌落總數(shù)）10-110-210-3度之比或cfu/mL)/(cfu/mL或cfu/g)1多不可計(jì)16420-1640016000或1.6x1042多不可計(jì)295461.63775038000或3.8x1043多不可計(jì)271602.22710027000或2.7X1044多不可計(jì)多不可計(jì)313-3130

10、00310000或3.1X105527115-270270或6000-V10V107多不可計(jì)30512-3050031000或3.1X1041）生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)： 初步發(fā)酵試驗(yàn)：在2個(gè)各裝有50mL的3倍濃縮乳糖膽鹽蛋白月東培養(yǎng)液（可稱為三倍乳糖膽鹽）的三角瓶中（內(nèi)有倒置杜氏小管），以無(wú)菌操作各加水樣100mL。在10支裝有5mL的三倍乳糖膽鹽的發(fā)酵試管中（內(nèi)有倒置小管），以無(wú)菌操作各加入水樣10mL。如果飲用水的大腸菌群數(shù)變異不大，也可以接種3份100mL水樣。搖勻后，37C培養(yǎng)24h。 平板分離：經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板

11、（EMB培養(yǎng)基）上，37C培養(yǎng)1824h。大腸菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屆光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：將革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發(fā)酵管中，為防止遺漏，每管可接種來(lái)自同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落13個(gè)，37C培養(yǎng)24h,如果產(chǎn)酸乂產(chǎn)氣者，即證實(shí)有大腸菌群存在。 報(bào)告：根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的復(fù)發(fā)酵管的陽(yáng)性管數(shù)，查表107-2（或表107-3），報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)（MPN）。2）水源水的檢驗(yàn)：用于檢驗(yàn)的水樣量，應(yīng)根據(jù)預(yù)計(jì)水源水的污染程度選用下列各量。 嚴(yán)重污染水

12、：1,0.1,0.01.0.00lmL各1份。 中度污染水：10.1,0.1,0.01mL各1份。 輕度污染水：100,10,1,0.1mL各l份。 大腸菌群變異不大的水源水：10mLl0份。表2大腸菌群檢索表（飲用水）012備注每升水樣中大腸菌群數(shù)0230表3大腸困群數(shù)變異不大的飲用水陽(yáng)性管數(shù)0123接種水樣總量每升水樣中大腸菌群數(shù)v341118300mL(3份100mL)表4大腸菌群檢索表（嚴(yán)重污染水）接種水樣量/mL每升水樣中備注10.10.010.001大腸菌群數(shù)-v900-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900接種水樣總-+-2200量為1.111+-2300(

13、1,0.1,-+28000.01,+-+92000.001mL+-+-9400各一份）+-+18000+-23000+-+96000+-238000+238000表5大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中大腸菌群數(shù)備注1010.10.01-v90-+90-+-90-+-95-+180-+-+190接種水樣總-+-220量為11.11+-230(10,1,-+2800.1,0.01+-+920mL各一+-+-940份）+-+1800+-2300+-+9600+-23800+23800表6大腸菌群檢索表（輕度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中備注1001010.1大腸菌群數(shù)-v9-

14、+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19接種水樣總-+-22量為111.1+-23(100,10,-+281,0.1mL+-+92各一份）+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+2380表7大腸菌群變異不大的水源水陽(yáng)性管數(shù)012345678910每升水樣中V10112236516992120160230大腸菌群數(shù)230備注接種水樣總量100mL（10mL10份）操作步驟同生活用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)注意，接種量1mL及1mL以內(nèi)用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管；接種量在1mL以上者，應(yīng)保證接種后發(fā)酵管（瓶）中的總液體量為單倍培養(yǎng)液量。然后根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽(yáng)性管（瓶）

15、數(shù)，查表107-4、表107-5、表107-6或表107-7,報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)（MPN）。附：濾膜法濾膜法所使用的濾膜是一種微孔濾膜。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的濾器中，經(jīng)過(guò)抽濾，細(xì)菌即被均勻地截留在膜上，然后將濾膜貼丁大腸菌群選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。再鑒定濾膜上生長(zhǎng)的大腸菌群的菌落，計(jì)算出每升水樣中含有的大腸菌群數(shù)（MPN）。（1）準(zhǔn)備工作：1）濾膜滅菌：將3號(hào)濾膜放入燒杯中，加入蒸僻水，置丁沸水浴中蒸煮滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需換無(wú)菌水洗滌2-3次，以除去殘留溶劑。2）濾器滅菌：準(zhǔn)備容量為500mL的濾器，用點(diǎn)燃的灑精棉球火焰滅菌，也可用121C高壓滅菌20min。3）培養(yǎng):3）培養(yǎng)：將品紅業(yè)硫酸鈉培養(yǎng)基放入37C培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫30-60min。（2）過(guò)濾水樣：1）用無(wú)菌鑲子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將祖糙面向上貼放于已滅菌的濾床上，輕輕地固定好濾器漏斗。水樣搖勻后，取333mL注入濾器中，加蓋，打開濾器閥門，在一50kPa壓力下進(jìn)行抽濾。2）水樣濾完后再抽氣約5s,關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用無(wú)菌鑲子夾取濾膜邊緣部分，