非圖案化法制備柔性連續(xù)葡萄糖監(jiān)測傳感器

1、非圖案化法制備柔性連續(xù)葡萄糖監(jiān)測傳感器Symbolm1?cmSymbolm2,檢出限為0.05mmol/L(S/N=3),且傳感器有良好的長期穩(wěn)定性和抗干擾性，可用于皮下連續(xù)血糖監(jiān)測。1 引言糖尿病是嚴重威脅人類健康的常見慢性病之一，目前仍無法治愈，但有效的血糖管理可以大幅降低并發(fā)癥的發(fā)生率，提高患者生活質量。連續(xù)血糖監(jiān)測系統(tǒng)(CGMS的出現(xiàn)1,為血糖監(jiān)控提供了完整的趨勢信息，并能提供高、低血糖的報警功能，能將患者每日指血測量的次數(shù)降低到12次，甚至于無需指血校準2，是繼指血血糖儀之后的又一重要發(fā)明。目前，這類傳感器通常是以柔性聚合物薄膜為基底，在其上印刷碳電極或濺射金電極，通過電極的層層組裝

2、3或平面錯位排布4形成電化學三電極體系；或者直接利用極細的金屬絲制作5，6，以金屬絲表面的絕緣層隔離工作電極與參比電極，形成二電極體系。但這些方法制作的傳感器材料成本高，工藝復雜、規(guī)?；潭鹊停沟眠@類產(chǎn)品生產(chǎn)成本高，價格昂貴，制約了CGM漆統(tǒng)的推廣應用。近年來，仿生學研究發(fā)現(xiàn)，在水溶液條件下，多巴胺能發(fā)生氧化聚合，在聚合物、金屬、陶瓷、玻璃、木材等一系列固體材料表面形成一層超強附著的復合層。而多巴胺的鄰苯二酚基團能夠對金屬產(chǎn)生一定強度的束縛力，且對金屬離子具有較強的還原能力，當表面沉積聚多巴胺層的改性材料浸入金屬鹽溶液中時，復合層從溶液中還原金屬陽離子并使之沉積在材料表面，從而實現(xiàn)無電鍍的材

3、料表面金屬化7。這是一種有別于光刻、絲網(wǎng)印刷、噴印、磁控濺射等技術的有機薄膜表面金屬化方法，非常適合用于構建薄膜型電化學電極。本研究利用該技術，在聚酰亞胺（PI）薄膜表面化學沉積一層致密的金層，然后以薄膜兩面的金層分別作為工作電極與參比對電極，構成電化學兩電極體系，形成一種單層雙面柔性薄膜電極。以此為基礎，在設定的工作電極表面電沉積花瓣狀鉑納米顆粒作為催化層；在碳納米管（CNT）的Nafion分散液中電泳吸附CNT形成CNT/Nafion網(wǎng)孔結構，作為抗干擾層；并在其上通過電吸附葡萄糖氧化酶，形成酶生化敏感層；最后，在戊二醛中交聯(lián)固化后涂覆聚氨酯（PU）傳質限制層，構成葡萄糖檢測傳感器。制備的

4、傳感器表現(xiàn)出良好的葡萄糖連續(xù)檢測性能，兼具柔性、微細、長期穩(wěn)定性好、抗干擾性強的特點，而此制備方法具有原材料成本低，可成板制備，切割成型，易于實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點，有望應用于低成本皮下連續(xù)葡萄糖監(jiān)測傳感器的開發(fā)中。2 實驗部分2.1 儀器與試劑CHI660E型電化學工作站（上海辰華公司）；Sirion100型場發(fā)射掃描電鏡（荷蘭FEI公司）；激光切割機（深圳立華激光公司）。聚酰亞胺（PI）薄膜（Kapton500HN,3M公司）；聚氨酯（PU）、Nafion（5%，w/V）、牛血清蛋白（BSA）、多巴胺鹽酸鹽（Sigma公司）；十八烷基三甲基氯化錢（STAC上海阿拉丁生化科技XX公司）；四氫味

5、喃（THE、二甲基甲酰胺（DMF、抗壞血酸（AA）、尿酸（UA）、醋氨酚（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD，200U/mg）、葡萄糖、戊二醛（25%w/V）、氯鉗酸、氯金酸、硼氫化鈉、醋酸鉛、H2O2（國藥集團上海試劑公司）；碳納米管水性分散液（7%-8%w/V,中國科學院成都有機化學XX公司）；TrisHCl（pH8.5）、0.01mol/LPBS緩沖液（武漢博士德生物工程XX公司）；實驗用水為去離子水；所有試劑均為分析純。實驗在室溫下進行。2.2 聚酰亞胺薄膜表面金屬化將清潔后的PI薄膜（10cmX4cm）浸入多巴胺鹽酸鹽溶液（2mg/mL，pH8.5）中，室溫下緩慢振蕩24h，使PI薄膜表面

6、形成一層聚多巴胺（記為PI/DOPA）。將PI/DOPA片浸入STAC溶液（0.1%,w/V）中靜置5s后，迅速轉移到鉗納米溶膠8中，1min后取出晾干，使PI/DOPA表面靜電吸附一層隨機分布的鉑納米顆粒；然后浸入鍍金液（含10mmol/L氯金酸與20mmol/L過氧化氫）進行化學沉積，5min后取出并在200烘箱中退火5min，使聚酰亞胺薄膜表面形成一層光亮致密的金層（記為PI/Au）。2.3 傳感器制備設定工作區(qū)域為5mm,引線部分為1cm,其余部分為絕緣區(qū)域（3.5cm），在PI/Au兩面設定的絕緣區(qū)域氣相沉積Parylene（記為PI/Au/Parylene）。然后以Pt片為對電極，

7、用恒電位法，設定工作電位Symbolm2.5V，沉積時間120s，在設定的工作區(qū)域電沉積鉗黑層（記為PtPt）,其中，鍍鉗液為3%（w/V）氯鉗酸和0.25%（w/V）醋酸鉛的混合溶液；接著，在CNT/Nafion混合溶液（1：4,V/V）中，以R面作為對電極，W面為工作電極，用恒電位法，設定工作電壓為1.0V,工作時間90s,在W面上電泳吸附CNT形成以CNT為骨架的Nafion網(wǎng)絡層（記為Pt/CNTPt）o然后，同樣用恒電位法，設定工作電壓為0.7V,工作時間20min,在GO附液（含10wt%勺BSA中，將GODfe吸附于W面，接著在4c冰箱中干燥8h,使GO比分嵌入到CNT網(wǎng)絡層內.

8、然后，在40c烘箱中，將W面懸掛于底部含25%X二醛的密封腔中進行交聯(lián)，40min后取出并置于4冰箱中保存8h,使酶層充分交聯(lián)固化（記為Pt/CNT/GOxPt）。然后用激光切割機將薄膜切割成0.5mrmc4cm的細針狀，其中工作區(qū)域為0.5mrm（5mm最后，讓針型傳感器的工作區(qū)域緩緩穿過沾有4%w/V）PU溶液（THFDMF98：2,V/V）的鋼絲圈（=2mn）,在其表面形成一層多孔保護膜。涂膜后的傳感器在干燥箱中干燥8h后，在PBS容液中浸泡72h,使傳感器各層充分調控融合。制備的傳感器放在4保存?zhèn)溆谩鞲衅髦苽涫疽鈭D如圖1所示。2.4 葡萄糖連續(xù)響應測試測試在CHI660E電化學工作站

9、上進行，采用計時電流(it)法進行葡萄糖連續(xù)響應測試。設定工作電位0.3V，磁子轉速200r/min,檢測池內PBS溶液(0.01mol/L,pH7.2)溫度37Co上電初始化40min后，每隔5min，向檢測池中注射適量濃度葡萄糖溶液，使檢測池中的葡萄糖濃度按4mmol/L的梯度遞增。3 結果與討論3.1 傳感器各層表面形態(tài)表征利用掃描電鏡觀察各層表面形態(tài)。圖2a是PI鍍金薄膜橫切面，金層厚約10以m,與PI表面緊密結合。圖2b是鍍金層表面，可觀察到整齊、緊致、均勻分布的金納米顆粒。圖2c是鉑催化層，鉗納米顆粒呈花瓣狀，單個花瓣平均長度400500nm,平均寬度150250nm。圖2d是Na

10、fion/CNT多孔網(wǎng)絡層，可見Nafion以CNT為骨架，呈多孔網(wǎng)絡結構狀。圖2e是葡萄糖氧化酶層，可看到GO端入并覆蓋Nafton/CNT網(wǎng)孔，形成一層多孔、厚實的酶層。圖2f為PU外膜層，其中，PU呈多孔結構，孔徑分布范圍為24mb3.2 傳感器對葡萄糖的響應性能傳感器對葡萄糖的連續(xù)響應測試如圖3所示，在最優(yōu)條件下，傳感器對葡萄糖響應的線性范圍為2.032.0mmol/L,相關系數(shù)r=0.98(圖3左上插圖)，響應靈敏度為25以A?(mmol/L)Symbolm1?cmSymbolm2,檢出限為0.05mmol/L(S/N=3)。如此高的響應靈敏度一方面得益于催化層中花瓣狀的鉗納米顆粒對

11、H2O2有極強的電化學催化能力10，使酶層催化葡萄糖反應生成的H2O2迅速分解，從而產(chǎn)生較強響應電流；另一方面，鉑納米花層大大增加了電極的比表面積，從而產(chǎn)生更大的響應電流。本傳感器具有較快的響應速度，以葡萄糖濃度從8mmol/L到12mmol/L變化時為例，從注射高濃度葡萄糖至達到90%穩(wěn)態(tài)響應值的用時24s(圖3右下插圖)，30s內達到穩(wěn)態(tài)響應值。考慮到每次從注射葡萄糖到檢測池濃度達到均衡所花費時間的影響，單次濃度梯度變化的響應時間在2535s內。快速的響應速度既取決于Pt催化層對H2O2的快速響應能力，也取決于單層雙面的傳感器電極結構。工作電極與參比/對電極之間僅間隔一層PI膜，厚度僅12

12、7以m,電極間如此近的距離，縮小了以O2擴散完成電子傳遞的距離，從而加快電子傳遞速度，獲得較快的響應速度。然而，較小的電極間隙，也帶來了電子在兩極之間來回穿梭而形成的穿梭電流對響應的影響3，尤其是在較高的濃度梯度下，穿梭電流帶來了較大的背景噪聲。3.3 一致性測試隨機挑選同一片PI膜經(jīng)激光切割后的8根傳感器，對比其涂覆PU膜前后，傳感器的線性響應范圍，如圖4所示。從圖4a可見，經(jīng)激光切割后，傳感器的批量一致性好，但受酶反應動力學米氏常數(shù)的限制，其線性響應范圍小。經(jīng)手工涂覆PU膜后，在PU傳質限制膜的作用下，傳感器的線性范圍明顯擴大，但由于實驗條件限制，用手工完成涂膜，涂膜操作的速度，周邊環(huán)境溫

13、濕度的輕微變化都可能影響成膜的效果，因此，出現(xiàn)了涂膜后傳感器一致性變差的情況，如圖4b所示。3.4 抗干擾實驗對電活性物質的抗干擾性是決定葡萄糖傳感器準確性的重要指標，為能直接考察傳感器的抗干擾特性，對未涂PU傳質限制層的傳感器進行連續(xù)梯度測試。如圖5所示，本傳感器對尿酸（UA）、抗壞血酸（AA）、醋氨酚（APP都有良好的抗干擾性，這是由于Nafion/CNT網(wǎng)絡多孔內層，對傳感器的抗干擾性起到積極的作用11，另一方面，本傳感器工作電位低（0.3V），大大降低了電極對抗壞血酸等電活性物質的響應，進一步提高了傳感器的抗干擾性。3.5 PU膜生物兼容性實驗植入皮下工作的葡萄糖傳感器靈敏度會隨著酶活

14、性的下降，傳感器表面的蛋白吸附而下降。對涂有PU膜的傳感器進行仿生理環(huán)境的體外測試結果如圖6所示。在37水浴環(huán)境下，將傳感器浸入胎牛血清中長期浸泡后，每隔一定時間取出進行葡萄糖連續(xù)響應測試，結果表明，浸泡3d后，傳感器的連續(xù)梯度響應性能比剛涂覆過PU膜的傳感器性能略有提升，這是由于外層PU膜在連續(xù)浸泡后，傳感器各層之間的調控更加連續(xù)一致。但浸泡15d后，對36mmol/L濃度時的最大響應電流約降為初始值的75%；浸泡30d后，約降為初始值的65%。這可能是由于隨著傳感器長期在胎牛血清中的浸泡，PU表面多孔結構開始出現(xiàn)緩慢降解，促使蛋白吸附量逐漸增加，減少了傳感器的有效面積所致。但此時的靈敏度仍

15、達10以A?（mmol/L）Symbolm1?cmSymbolm2，可以滿足連續(xù)監(jiān)測的要求。4 結論以表面化學鍍金的PI薄膜為基體電極，成功制備了一種柔性細針狀葡萄糖傳感器，本傳感器在2.032.0mmol/L的線性響應范圍內，靈敏度為25以A?cmSymbolm2?（mmol/L）Symbolm1，在胎牛血清中連續(xù)浸泡30d，響應信號約為初始狀態(tài)的65%，適用于皮下連續(xù)葡萄糖監(jiān)測。本傳感器制備采用激光切割成型，易于實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，后期可改進PU涂膜方式為機涂，提高傳感器批量生產(chǎn)的一致性。References1 MastrototaroJ.J.Pediatr.EndocrMet.，1999，1

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