酵母菌的制片與觀察

1、酵母菌的染色與觀察摘要：本實驗通過用美藍染色制成水浸片來觀察酵母形態(tài)和出芽生殖方式，并區(qū)分酵母菌死活細胞。以生長在麥氏培養(yǎng)基上的釀酒酵母為材料，采用Schaeffer-Fulton氏染色法，進行子囊池子的觀察。關(guān)鍵詞：酵母菌水浸片法子囊胞子出芽生殖前言酵母菌是單細胞的真核微生物，細胞核和細胞質(zhì)有明且分化，個體比細菌大得多。酵母菌的形態(tài)通常有球狀、卵圓狀、橢圓狀、柱狀或香腸狀等多種。酵母菌的無性繁殖有芽殖、裂殖和產(chǎn)生胞子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊抱子。美藍為無毒性染料，其氧化型為藍色，而還原型為無色。用它對酵母菌染色時，由于活細胞的新陳代謝作用，使細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的

2、氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細胞無色；對于死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，用美藍水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細胞。子囊胞子是子囊菌類真菌有性生殖產(chǎn)生的有性胞子。在酵母菌中，能否形成子囊抱子及其形態(tài)是酵母菌分類鑒定的重要依據(jù)之一。酵母菌形成子囊胞子需要一定的條件，所以對不同種屬的酵母要選擇適合形成子囊抱子的培養(yǎng)基。麥氏（McClary）培養(yǎng)基（葡萄糖-醋酸鈉培養(yǎng)基）有利于釀酒酵母子囊抱子的形成。1材料1.1 菌種釀酒酵母麥氏瓊脂斜面培養(yǎng)物。1.2 溶液和試劑葡萄糖，KCl,酵母浸膏，醋酸鈉，瓊脂，蒸儲水，5%孔

3、雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液，95%乙醇，0.01%美蘭水溶液。1.3 儀器和其他用品酒精燈，載玻片，蓋玻片，顯微鏡，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，燒杯，試管等。2實驗步驟培養(yǎng)基的制備麥氏瓊脂培養(yǎng)基的制備麥氏（Meclary）瓊脂培養(yǎng)基的配方如下:成分葡錮糖KCl醋酸鈉瓊脂蒸儲水含量0.2g0.36g0.5g.1.64g4g200mL113c滅菌30min。液體培養(yǎng)基的制備取0.5g酵母膏、1g蛋白月東、2g葡萄糖加入100ml水配制成液體培養(yǎng)基。斜面接種無菌操作由釀酒酵母麥氏瓊脂斜面培養(yǎng)物挑取菌種，在已冷凝好的斜面培養(yǎng)基上劃線接種。培養(yǎng)在28C條件下恒溫培養(yǎng)7d。美藍染液水

4、浸片法制片在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍染液，無菌操作法取培養(yǎng)基中培養(yǎng)的酵母菌少許，放在呂氏堿性美藍染液中，使菌體與染液均勻混合。用鐐子夾蓋玻片一塊，小心蓋在液滴上。鏡檢將制好的水浸片放置3min后鏡檢。先用低倍鏡觀察，然后換用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，同時可以根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死、活細胞。30min后再次觀察。子囊抱子觀察制片在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜。干燥固定待涂片自然干燥后，讓菌膜朝上，通過火焰23次進行固定（以不燙手為宜）。染色加5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，染色11.5min。水洗用緩流自來水

5、輕輕沖洗，直至流出的水無色為止。乙醇脫色用95%的乙醇脫色30s,立即用水洗去乙醇。復染用0.5%番紅液染色30s1min。水洗用水輕輕地沖洗，直至流出的水無色為止。鏡檢將載玻片晾干后，先低倍再高倍，最后在油鏡觀察酵母菌。3結(jié)果與分析實驗結(jié)果美藍浸片觀察實驗結(jié)果（見圖1、2）在高倍顯微鏡下可以看到，釀酒酵母菌為單細胞，呈卵圓形或圓形，個體較大，細胞內(nèi)有明顯的液泡。酵母菌無性繁殖主要是出芽生殖，出芽時，由母細胞生出小突起，為芽體（芽抱子）?；钪慕湍妇毎尸F(xiàn)無色，死亡的酵母菌細胞被染成藍色。因為美藍是一種無毒性染料，它的氧化型是藍色的，而還原型是無色的。用它來對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞

6、中新陳代謝的作用，使細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細胞無色，而對于死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。在30min后觀察該片，藍色細胞增多。得出美藍染液的作用時間會使釀酒酵母的死細胞增多，細胞死、活比例增大。&出芽細胞10X40圖1酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖2-1美藍水浸片3min(10X40)圖2-2美藍水浸片30min(10X40)酵母菌的子囊抱子，呈現(xiàn)綠色。這是因為先用著色力強的染色劑孔雀綠染色，子囊中殘留染料經(jīng)酒精脫色，而抱子一經(jīng)染色難以脫色，后用番紅染液復染，子囊被染成紅色。3.3思考題.根據(jù)你的觀察結(jié)果，呂氏堿性美藍染液的作用時間與釀酒酵母的死活細胞比例變化是否有關(guān)系？答：有。隨著作用時間的延長，死活細胞的比例增大。.釀酒酵母除了通過出芽方式進行無性繁殖外，還可以形成子囊抱子進行有性繁殖，你在實驗中是否觀察到釀酒酵母的子囊抱子？答：通過染色，可以觀察到釀酒酵母的子囊抱子為圓形的小細胞，呈現(xiàn)綠色。4小結(jié)通過本實驗，了解了酵母菌的形態(tài)及出芽方式，并用美藍染液水浸片法區(qū)別酵母菌的死活細胞，掌握了子囊染色觀察方法，并了解酵母菌通過形成子囊抱子進行有性生殖。本實驗中滴加染液要適中，否則用蓋玻片覆蓋時，染液過多會溢出，過少會產(chǎn)生大量