酵母菌的制片與觀察

1、酵母菌的染色與觀察摘要：本實(shí)驗(yàn)通過用美藍(lán)染色制成水浸片來觀察酵母形態(tài)和出芽生殖方式，并區(qū)分酵母菌死活細(xì)胞。以生長在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上的釀酒酵母為材料，采用Schaeffer-Fulton氏染色法，進(jìn)行子囊池子的觀察。關(guān)鍵詞：酵母菌水浸片法子囊胞子出芽生殖前言酵母菌是單細(xì)胞的真核微生物，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)有明且分化，個(gè)體比細(xì)菌大得多。酵母菌的形態(tài)通常有球狀、卵圓狀、橢圓狀、柱狀或香腸狀等多種。酵母菌的無性繁殖有芽殖、裂殖和產(chǎn)生胞子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊抱子。美藍(lán)為無毒性染料，其氧化型為藍(lán)色，而還原型為無色。用它對(duì)酵母菌染色時(shí)，由于活細(xì)胞的新陳代謝作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的

2、氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無色；對(duì)于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。因此，用美藍(lán)水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死、活細(xì)胞。子囊胞子是子囊菌類真菌有性生殖產(chǎn)生的有性胞子。在酵母菌中，能否形成子囊抱子及其形態(tài)是酵母菌分類鑒定的重要依據(jù)之一。酵母菌形成子囊胞子需要一定的條件，所以對(duì)不同種屬的酵母要選擇適合形成子囊抱子的培養(yǎng)基。麥?zhǔn)希∕cClary）培養(yǎng)基（葡萄糖-醋酸鈉培養(yǎng)基）有利于釀酒酵母子囊抱子的形成。1材料1.1 菌種釀酒酵母麥?zhǔn)檄傊泵媾囵B(yǎng)物。1.2 溶液和試劑葡萄糖，KCl,酵母浸膏，醋酸鈉，瓊脂，蒸儲(chǔ)水，5%孔

3、雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液，95%乙醇，0.01%美蘭水溶液。1.3 儀器和其他用品酒精燈，載玻片，蓋玻片，顯微鏡，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，燒杯，試管等。2實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)基的制備麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基的制備麥?zhǔn)希∕eclary）瓊脂培養(yǎng)基的配方如下:成分葡錮糖KCl醋酸鈉瓊脂蒸儲(chǔ)水含量0.2g0.36g0.5g.1.64g4g200mL113c滅菌30min。液體培養(yǎng)基的制備取0.5g酵母膏、1g蛋白月東、2g葡萄糖加入100ml水配制成液體培養(yǎng)基。斜面接種無菌操作由釀酒酵母麥?zhǔn)檄傊泵媾囵B(yǎng)物挑取菌種，在已冷凝好的斜面培養(yǎng)基上劃線接種。培養(yǎng)在28C條件下恒溫培養(yǎng)7d。美藍(lán)染液水

4、浸片法制片在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液，無菌操作法取培養(yǎng)基中培養(yǎng)的酵母菌少許，放在呂氏堿性美藍(lán)染液中，使菌體與染液均勻混合。用鐐子夾蓋玻片一塊，小心蓋在液滴上。鏡檢將制好的水浸片放置3min后鏡檢。先用低倍鏡觀察，然后換用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，同時(shí)可以根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死、活細(xì)胞。30min后再次觀察。子囊抱子觀察制片在潔凈無脂的載玻片中央滴一小滴無菌水，用無菌操作方法從菌種斜面挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜。干燥固定待涂片自然干燥后，讓菌膜朝上，通過火焰23次進(jìn)行固定（以不燙手為宜）。染色加5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，染色11.5min。水洗用緩流自來水

5、輕輕沖洗，直至流出的水無色為止。乙醇脫色用95%的乙醇脫色30s,立即用水洗去乙醇。復(fù)染用0.5%番紅液染色30s1min。水洗用水輕輕地沖洗，直至流出的水無色為止。鏡檢將載玻片晾干后，先低倍再高倍，最后在油鏡觀察酵母菌。3結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果美藍(lán)浸片觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖1、2）在高倍顯微鏡下可以看到，釀酒酵母菌為單細(xì)胞，呈卵圓形或圓形，個(gè)體較大，細(xì)胞內(nèi)有明顯的液泡。酵母菌無性繁殖主要是出芽生殖，出芽時(shí)，由母細(xì)胞生出小突起，為芽體（芽抱子）?；钪慕湍妇?xì)胞呈現(xiàn)無色，死亡的酵母菌細(xì)胞被染成藍(lán)色。因?yàn)槊浪{(lán)是一種無毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的，而還原型是無色的。用它來對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞

6、中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，所以酵母的活細(xì)胞無色，而對(duì)于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。在30min后觀察該片，藍(lán)色細(xì)胞增多。得出美藍(lán)染液的作用時(shí)間會(huì)使釀酒酵母的死細(xì)胞增多，細(xì)胞死、活比例增大。&出芽細(xì)胞10X40圖1酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖2-1美藍(lán)水浸片3min(10X40)圖2-2美藍(lán)水浸片30min(10X40)酵母菌的子囊抱子，呈現(xiàn)綠色。這是因?yàn)橄扔弥?qiáng)的染色劑孔雀綠染色，子囊中殘留染料經(jīng)酒精脫色，而抱子一經(jīng)染色難以脫色，后用番紅染液復(fù)染，子囊被染成紅色。3.3思考題.根據(jù)你的觀察結(jié)果，呂氏堿性美藍(lán)染液的作用時(shí)間與釀酒酵母的死活細(xì)胞比例變化是否有關(guān)系？答：有。隨著作用時(shí)間的延長，死活細(xì)胞的比例增大。.釀酒酵母除了通過出芽方式進(jìn)行無性繁殖外，還可以形成子囊抱子進(jìn)行有性繁殖，你在實(shí)驗(yàn)中是否觀察到釀酒酵母的子囊抱子？答：通過染色，可以觀察到釀酒酵母的子囊抱子為圓形的小細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色。4小結(jié)通過本實(shí)驗(yàn)，了解了酵母菌的形態(tài)及出芽方式，并用美藍(lán)染液水浸片法區(qū)別酵母菌的死活細(xì)胞，掌握了子囊染色觀察方法，并了解酵母菌通過形成子囊抱子進(jìn)行有性生殖。本實(shí)驗(yàn)中滴加染液要適中，否則用蓋玻片覆蓋時(shí)，染液過多會(huì)溢出，過少會(huì)產(chǎn)生大量