項目葡萄糖注射液的細菌內(nèi)毒素檢查ppt

1、重慶醫(yī)藥高等專科學校 項目項目145%葡萄糖注射液的細菌內(nèi)毒素檢查葡萄糖注射液的細菌內(nèi)毒素檢查提綱提綱 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 第二節(jié)第二節(jié) 熱原檢查法熱原檢查法 第三節(jié)第三節(jié) 細菌內(nèi)毒素檢查法細菌內(nèi)毒素檢查法第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、熱原一、熱原熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。的致熱物質(zhì)。熱原反應熱原反應：超量熱原物質(zhì)的注射液：超量熱原物質(zhì)的注射液靜脈輸入人體，通常在靜脈輸入人體，通常在0.5-2h0.5-2h內(nèi)引內(nèi)引起外周皮膚血管收縮，停止排汗，起外周皮膚血管收縮，停止排汗，散熱減少，發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、散熱減少

2、，發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐，嚴重時可出現(xiàn)頭痛、惡心、嘔吐，嚴重時可出現(xiàn)昏迷、休克、死亡等一系列臨床癥昏迷、休克、死亡等一系列臨床癥狀，體溫通?？缮仙翣?，體溫通常可上升至4040左右。左右。2006年，年，“欣弗欣弗”克林霉素磷酸酯葡萄克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液，導致多起悲劇發(fā)生。糖注射液，導致多起悲劇發(fā)生。 2009年，西安嘉惠藥業(yè)有限年，西安嘉惠藥業(yè)有限公司，腎康注射液，因熱原公司，腎康注射液，因熱原檢查不合格被緊急召回檢查不合格被緊急召回二、消除熱原的方法二、消除熱原的方法1.高溫法高溫法 180干烤干烤34h或或250干烤干烤1h以上以上2.吸附法吸附法 常見的吸附劑如活

3、性炭、石棉、白陶土等吸附常見的吸附劑如活性炭、石棉、白陶土等吸附3.濾過法濾過法 超濾法（超濾法（3.015nm）超濾膜）超濾膜4.蒸餾法蒸餾法 多次蒸餾，并加有隔沫裝置多次蒸餾，并加有隔沫裝置5.酸堿法酸堿法 強酸、強堿、強氧化劑破壞強酸、強堿、強氧化劑破壞6.其它方法其它方法 離子交換法、凝膠濾過法、反滲透法等離子交換法、凝膠濾過法、反滲透法等三、熱原和細菌內(nèi)毒素的關(guān)系三、熱原和細菌內(nèi)毒素的關(guān)系 熱原主要來源于革蘭陰性菌的細菌內(nèi)毒素（脂多糖）熱原主要來源于革蘭陰性菌的細菌內(nèi)毒素（脂多糖），除此外還包括一些病毒、干擾素等。，除此外還包括一些病毒、干擾素等。 因此，嚴格來講，不是每一種熱原都具

4、有細菌內(nèi)毒素因此，嚴格來講，不是每一種熱原都具有細菌內(nèi)毒素（脂多糖）的結(jié)構(gòu)。（脂多糖）的結(jié)構(gòu)。 但所有已知的細菌內(nèi)毒素（脂多糖）都有熱原活性，但所有已知的細菌內(nèi)毒素（脂多糖）都有熱原活性，控制內(nèi)毒素就是控制熱原?？刂苾?nèi)毒素就是控制熱原。 四、熱原檢查與細菌內(nèi)毒素檢查的關(guān)系四、熱原檢查與細菌內(nèi)毒素檢查的關(guān)系 熱原檢查法比較成熟，但易受試驗動物個體差異，方熱原檢查法比較成熟，但易受試驗動物個體差異，方法靈敏度、藥物本身性質(zhì)（如乳糖酸紅霉素引起降溫，兩法靈敏度、藥物本身性質(zhì)（如乳糖酸紅霉素引起降溫，兩性霉素性霉素B 可引起升溫）等影響，使用受到一定限制；細菌可引起升溫）等影響，使用受到一定限制；細菌

5、內(nèi)毒素檢查靈敏度高、準確、快速和廉價，但仍有部分藥內(nèi)毒素檢查靈敏度高、準確、快速和廉價，但仍有部分藥物因為干擾等其他因素無法使用。物因為干擾等其他因素無法使用。 兩種方法目前都是可行的內(nèi)毒素物質(zhì)檢查方法，在實兩種方法目前都是可行的內(nèi)毒素物質(zhì)檢查方法，在實際應用過程中可以際應用過程中可以結(jié)合藥物本身性質(zhì)結(jié)合藥物本身性質(zhì)進行選擇。進行選擇。 第二節(jié)第二節(jié) 熱原檢查法（家兔升溫法）熱原檢查法（家兔升溫法） 該法是將一定量的供試品靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)該法是將一定量的供試品靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所定時間內(nèi)觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度

6、是否符合規(guī)定。含熱原的限度是否符合規(guī)定。熱原檢查法中，對試驗動物有怎樣的要求，為什么要這樣規(guī)定？本節(jié)內(nèi)容本節(jié)內(nèi)容 一、試驗動物一、試驗動物 二、試驗環(huán)境二、試驗環(huán)境 三、操作方法三、操作方法 四、結(jié)果判斷四、結(jié)果判斷 五、注意事項五、注意事項試驗動物試驗動物供試用的家兔應健康合格，體重供試用的家兔應健康合格，體重1.7kg以上，雌兔應無孕。以上，雌兔應無孕。預測體溫前預測體溫前7天即應用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間內(nèi)，體重天即應用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間內(nèi)，體重應不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異常現(xiàn)象。應不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異?，F(xiàn)象。未經(jīng)用于熱原檢查的家兔；供試品判定為符合規(guī)定但組內(nèi)未經(jīng)

7、用于熱原檢查的家兔；供試品判定為符合規(guī)定但組內(nèi)升溫達升溫達0.6家兔；或三周內(nèi)未曾使用的家兔，均應在檢查家兔；或三周內(nèi)未曾使用的家兔，均應在檢查供試品前供試品前37天內(nèi)預測體溫，進行挑選。天內(nèi)預測體溫，進行挑選。挑選試驗的條件與檢查供試品時相同，僅不注射藥液，挑選試驗的條件與檢查供試品時相同，僅不注射藥液，每隔每隔30min測量體溫測量體溫1次，共測次，共測8次，次，8次體溫均在次體溫均在38.039.6的范圍內(nèi)，且最高最低體溫的差數(shù)不超過的范圍內(nèi)，且最高最低體溫的差數(shù)不超過0.4的的家兔，方可供熱原檢查用。家兔，方可供熱原檢查用。 用于熱原檢查后的家兔，如供試品判定為符合規(guī)定，至用于熱原檢查

8、后的家兔，如供試品判定為符合規(guī)定，至少應休息少應休息48h方可供第方可供第2次檢查用，其中升溫達次檢查用，其中升溫達0.6的家的家兔應休息兩周以上。如供試品判定為不符合規(guī)定，則組兔應休息兩周以上。如供試品判定為不符合規(guī)定，則組內(nèi)全部家兔不再使用。內(nèi)全部家兔不再使用。測溫裝置：精密度測溫裝置：精密度0.10.1，測溫探頭或肛溫計插入肛門測溫探頭或肛溫計插入肛門的深度和時間各兔應相同，的深度和時間各兔應相同，深度約為深度約為6cm6cm，時間，時間1.5min1.5min。試驗環(huán)境試驗環(huán)境實驗室溫度：實驗室溫度： 17-25實驗室與飼養(yǎng)室溫差：實驗室與飼養(yǎng)室溫差： 5 實驗溫度變化：實驗溫度變化：

9、 3 實驗室：保持安靜，避免強光、噪音等刺激，注意實實驗室：保持安靜，避免強光、噪音等刺激，注意實驗兔之間相互影響。驗兔之間相互影響。操作方法操作方法 取適用的家兔取適用的家兔3只，測定其正常體溫后只，測定其正常體溫后15min以內(nèi)，自以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫熱至約耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫熱至約38的供試品溶液，的供試品溶液，然后每隔然后每隔30min按前法測量其體溫按前法測量其體溫1次，共測次，共測6次，以次，以6次體次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高度數(shù)溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高度數(shù)。如。如3只家兔中有只家兔中有1只體溫升高只體溫升高0.6或

10、或0.6以上，或以上，或3只家兔只家兔體溫升高均低于體溫升高均低于0.6，但升高的總數(shù)達，但升高的總數(shù)達1.3或或1.3以上以上，應另取，應另取5只家兔復試，檢查方法同上。只家兔復試，檢查方法同上。結(jié)果判斷結(jié)果判斷1、合格：合格：初試初試3只兔升溫均小于只兔升溫均小于0.6且升溫總和且升溫總和 1.3； 5只復試中僅只復試中僅1只升溫只升溫0.6且初試、復試共且初試、復試共8只兔升溫只兔升溫總和總和 3.5。2、不合格：不合格：初試初試3只兔中有只兔中有2只升溫只升溫0.6； 復試復試5只中只中2只只以上升溫以上升溫0.6；初試、復試共；初試、復試共8只兔升溫總和只兔升溫總和 3.5。注意事項

11、注意事項降溫問題降溫問題 主要原因有：室溫過低；家兔體質(zhì)問題；季節(jié)變換；在主要原因有：室溫過低；家兔體質(zhì)問題；季節(jié)變換；在注射大劑量供試品時，沒有進行預熱注射大劑量供試品時，沒有進行預熱38處理；測溫過程中處理；測溫過程中，肛門大量出血。，肛門大量出血。 處理方法：體溫降低處理方法：體溫降低0.4時，視為體溫正常波動，以時，視為體溫正常波動，以0計算。降溫計算。降溫0.6以上時，應找出原因，另取以上時，應找出原因，另取3只家兔重做。只家兔重做。降溫降溫0.450.55，3只中僅有只中僅有1只，以只，以0計算；計算；2只或只或2只以上只以上時，應找出原因重做。時，應找出原因重做。l實驗室環(huán)境不安

12、靜，動物受驚擾、騷動，可影響實驗結(jié)果。實驗室環(huán)境不安靜，動物受驚擾、騷動，可影響實驗結(jié)果。注射液使用時要預熱至注射液使用時要預熱至38，并注意注射速度，不宜過快。，并注意注射速度，不宜過快。肛溫計在使用前要進行校正。每年定期標定一次。肛溫計在使用前要進行校正。每年定期標定一次。家兔多次使用，會因多次少量接觸熱原而引致對熱原產(chǎn)生耐家兔多次使用，會因多次少量接觸熱原而引致對熱原產(chǎn)生耐受性受性 ，復試時，挑選對熱原敏感使用過，復試時，挑選對熱原敏感使用過23次的家兔進行試次的家兔進行試驗為宜。驗為宜。熱原檢查法中，對試驗動物有怎樣的要求，為什么要這樣規(guī)定？第三節(jié)第三節(jié) 細菌內(nèi)毒素檢查法細菌內(nèi)毒素檢查

13、法 利用利用鱟試劑鱟試劑與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的現(xiàn)象與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的現(xiàn)象，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。方法。 鱟試劑是從海洋無脊椎動物鱟試劑是從海洋無脊椎動物“鱟鱟”的的藍色血液中提取的變形細胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥精制藍色血液中提取的變形細胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥精制而成的生物制劑。而成的生物制劑。鱟鱟 鱟試劑中含有凝固酶原和凝固蛋白原，在適宜的條鱟試劑中含有凝固酶原和凝固蛋白原，在適宜的條件下（溫度、件下（溫度、pH、無干擾物質(zhì)等），能被微量的細菌內(nèi)、無干擾物質(zhì)等），能被微量的細菌內(nèi)毒素激活，而產(chǎn)生凝集

14、反應。毒素激活，而產(chǎn)生凝集反應。需建立內(nèi)毒素檢查項目的品種需建立內(nèi)毒素檢查項目的品種質(zhì)量標準中有家兔熱原檢查法需轉(zhuǎn)換為細菌內(nèi)毒素檢質(zhì)量標準中有家兔熱原檢查法需轉(zhuǎn)換為細菌內(nèi)毒素檢查方法的品種。查方法的品種。用于注射給藥，但未有熱原質(zhì)量控制的品種。用于注射給藥，但未有熱原質(zhì)量控制的品種。注射用新藥需建立熱原質(zhì)量控制的品種。注射用新藥需建立熱原質(zhì)量控制的品種。用于靜脈給藥的原輔料。用于靜脈給藥的原輔料。本節(jié)內(nèi)容本節(jié)內(nèi)容 一、基本概念一、基本概念 二、試驗流程二、試驗流程 試驗器具的準備試驗器具的準備 L和和MVD的確定的確定 供試品溶液的準備供試品溶液的準備 鱟試劑靈敏度的復核鱟試劑靈敏度的復核 干

15、擾試驗干擾試驗 CRE的稀釋的稀釋 供試品細菌內(nèi)毒素的檢查供試品細菌內(nèi)毒素的檢查 結(jié)果判斷結(jié)果判斷一、基本概念一、基本概念 （1）鱟試劑靈敏度（鱟試劑靈敏度（）：在細菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定條：在細菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定條件下使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度，用件下使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度，用EU/ml表示表示。 （2）細菌內(nèi)毒素的限值（細菌內(nèi)毒素的限值（L） ：為保證用藥安全，給：為保證用藥安全，給每一種藥物規(guī)定了相應的限值，只要低于該限值，按照規(guī)定每一種藥物規(guī)定了相應的限值，只要低于該限值，按照規(guī)定給藥途徑即為安全。常用于計算限值的公式為給藥途徑即為安全。常用于計算限值的公式為L=K/M

16、。 （3）最大有效稀釋倍數(shù)（最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）： 指供試品溶液被允指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測，常用的計算公式為素限值的檢測，常用的計算公式為MVD=cL/。 （4）細菌內(nèi)毒素國家標準品（細菌內(nèi)毒素國家標準品（RSE） ：系自大腸埃希：系自大腸埃希菌提取精制得到的內(nèi)毒素。用于標定細菌內(nèi)毒素工作標準菌提取精制得到的內(nèi)毒素。用于標定細菌內(nèi)毒素工作標準品的效價和標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度。品的效價和標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度。 （5）細菌內(nèi)毒素工作標準品（細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE）

17、 ：系以細菌內(nèi)：系以細菌內(nèi)毒素國家標準品為基準標定其效價。細菌內(nèi)毒素工作標準毒素國家標準品為基準標定其效價。細菌內(nèi)毒素工作標準品用于鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗和設置的各種陽性對品用于鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗和設置的各種陽性對照。照。 （6）細菌內(nèi)毒素檢查用水（細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET） ：指內(nèi)毒素含量：指內(nèi)毒素含量小于小于0.015EU/ml（凝膠法）或（凝膠法）或0.005EU/ml（光度測定法）且對內(nèi)毒（光度測定法）且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。一定量的細菌內(nèi)毒素一定量的細菌內(nèi)毒素可以被人體耐受，也可以被人體耐受，也是是SFDASFDA允許的，

18、只要允許的，只要保證藥品不含能導致保證藥品不含能導致患者發(fā)熱的足量細菌患者發(fā)熱的足量細菌內(nèi)毒素。內(nèi)毒素。二、試驗流程二、試驗流程鱟試劑鱟試劑限值確定限值確定最大有效稀最大有效稀釋倍數(shù)確定釋倍數(shù)確定干擾實驗干擾實驗供試品細菌內(nèi)毒供試品細菌內(nèi)毒素檢查素檢查結(jié)果判斷結(jié)果判斷靈敏度復核靈敏度復核供試品供試品試驗器具的準備試驗器具的準備1、試驗器具的要求、試驗器具的要求凝集管凝集管（1075）、）、刻度吸管和洗耳球（精密移液槍刻度吸管和洗耳球（精密移液槍和無熱原吸頭）和無熱原吸頭）、試管（試管（16100）和試管架）和試管架、安瓿架、安瓿架、封口膜、時鐘、無菌紗布、脫脂棉、吸水紙、剪刀、封口膜、時鐘、無

19、菌紗布、脫脂棉、吸水紙、剪刀。耐熱器皿常用干熱滅菌法（耐熱器皿常用干熱滅菌法（250、30 min以上），塑以上），塑料用具應選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械料用具應選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械（目前多為無熱原的一次性用品（目前多為無熱原的一次性用品 ）。）。細菌內(nèi)毒素限值（細菌內(nèi)毒素限值（L）：）：L ：供試品細菌內(nèi)毒素限值，以：供試品細菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或或EU/U表示。表示。K ：人每：人每kg體重每體重每h最大可接受的內(nèi)毒素劑量。注射劑最大可接受的內(nèi)毒素劑量。注射劑K=5EU/（kgh），放射性藥品注射劑），放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kgh

20、），鞘內(nèi)用注），鞘內(nèi)用注射劑射劑K=0.2EU/（kgh）。）。 M ：人用每：人用每kg體重每體重每h的最大供試品劑量，依據(jù)藥品說明書或的最大供試品劑量，依據(jù)藥品說明書或臨床用藥須知臨床用藥須知確定。確定。注意注意M一定要找到最大量，如果有一定要找到最大量，如果有兒童用量，按體重計一般高于成人量。兒童用量，按體重計一般高于成人量。MKL/2、L和和MVD的確定的確定例：某注射劑產(chǎn)品人用每公斤體重每小時的最大供試品劑例：某注射劑產(chǎn)品人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量為量為14.3mg/kg，其濃度為，其濃度為100mg/ml ，則，則L為多少（用為多少（用EU/ml 表示）？表示）？ 解：解

21、： M=14.3mg/kg，K=5 EU/（kgh） L=K/M=5/14.3=0.35EU/mg 又因為濃度為又因為濃度為100mg/ml ，所以：，所以： L=0.35 100=35EU/ml最大有效稀釋倍數(shù)：最大有效稀釋倍數(shù)： MVD=cL/L ：供試品的細菌內(nèi)毒素限值；：供試品的細菌內(nèi)毒素限值；：在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（：在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml）；）；c ：供試品溶液的濃度，當：供試品溶液的濃度，當L 以以EU/ml 表示時，則表示時，則c 等于等于1.0ml/ml，當，當L以以EU/mg 或或EU/U 表示時，表示時，c 的單位為的單位為mg/ml 或或U/m

22、l。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則，則MVD 取取1，即：，即：c=/L，此時，此時c又可以稱為供試品又可以稱為供試品的最小有效稀釋濃度（的最小有效稀釋濃度（MVC）。）。例例1：某葡萄糖注射液，其內(nèi)毒素限值為：某葡萄糖注射液，其內(nèi)毒素限值為0.5EU/ml，所用鱟試劑的靈敏度為所用鱟試劑的靈敏度為0.125EU/ml。則。則MVD為多少？為多少？ 解：由于解：由于L= 0.5EU/ml，所以，所以c=1ml/ml。 MVD=CL/=0.5/0.125=4例例2：已知鱟試劑的靈敏度：已知鱟試劑的靈敏度為為0.25EU/ml，枸櫞酸的內(nèi)毒，枸櫞酸的內(nèi)毒素限

23、值素限值L為為0.5EU/mg，計算其最小有效稀釋濃度（，計算其最小有效稀釋濃度（MVC）。）。解：由于枸櫞酸為固體，解：由于枸櫞酸為固體，MVD=1， 根據(jù)根據(jù)MVC=/L 即即MVC0.25/0.50.5mg/ml。3、供試品溶液的制備、供試品溶液的制備根據(jù)藥品的根據(jù)藥品的MVD或或MVC進行復溶、稀釋，制成所需濃度的進行復溶、稀釋，制成所需濃度的供試品溶液（供試品溶液（注意：稀釋或溶解時需采用注意：稀釋或溶解時需采用BET水水）。）。一般要求供試品溶液的一般要求供試品溶液的pH值在值在6.08.0的范圍內(nèi)。的范圍內(nèi)。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干

24、擾因子。4、CRE的稀釋的稀釋由于由于CRE濃度一般較大，使用前需進行稀釋。濃度一般較大，使用前需進行稀釋。稀釋過程（以稀釋過程（以CRE規(guī)格規(guī)格10EU為例）：為例）：0.030.060.1250.25.50110EEEEEEE0.3ml2.7mlW1.0ml1.0mlW1.0ml1.0mlW1.0ml1.0mlW1.0ml1.0mlW1.0ml1.0mlW當當使用新批號的鱟試劑使用新批號的鱟試劑或或試驗條件發(fā)生了任何可能影響試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變檢驗結(jié)果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。復核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否準確，也是復

25、核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否準確，也是考察檢驗人員操作方法是否正確及試驗條件是否符合規(guī)定考察檢驗人員操作方法是否正確及試驗條件是否符合規(guī)定。5、鱟試劑靈敏度的復核、鱟試劑靈敏度的復核 （1）試驗方法：根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（）試驗方法：根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（），將一），將一只只CRE用用BET溶解，制成溶解，制成2、0.5、0.25四種濃度的四種濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每一濃度平行做內(nèi)毒素標準溶液，每一濃度平行做4管，另外管，另外2管陰性對照管陰性對照（共（共18管）。管）。371的恒溫器中，保溫的恒溫器中，保溫602min。 （2）結(jié)果觀察：將反應管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)）

26、結(jié)果觀察：將反應管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180度，從凝膠是否變形和滑落判斷試驗結(jié)果。注意保溫和度，從凝膠是否變形和滑落判斷試驗結(jié)果。注意保溫和拿取試管的過程應避免受到振動造成假陰性結(jié)果。拿取試管的過程應避免受到振動造成假陰性結(jié)果。陽陽性性陰陰性性（3）結(jié)果判斷與計算：）結(jié)果判斷與計算： 若最大濃度若最大濃度2管均為陽性，最低濃度管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。性對照管為陰性，試驗方為有效。 反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（c）。）。c=lg-1（X/4） 式中式中X

27、為反應終點濃度的對數(shù)值。反應終點濃度是指系列為反應終點濃度的對數(shù)值。反應終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。 當當c在在0.52（包括（包括0.5和和2）時，方可用于內(nèi)毒素檢查）時，方可用于內(nèi)毒素檢查。但是注意要以標示靈敏度。但是注意要以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。為該批鱟試劑的靈敏度。例：某待復核鱟試劑的靈敏度標示值（例：某待復核鱟試劑的靈敏度標示值（）為）為0.25EU/ml。測得的結(jié)果如下，試判斷該鱟試劑能否用于細菌內(nèi)毒素檢測得的結(jié)果如下，試判斷該鱟試劑能否用于細菌內(nèi)毒素檢查。查。20.50.25 解：根據(jù)表格數(shù)據(jù)可

28、知，該試驗有效。解：根據(jù)表格數(shù)據(jù)可知，該試驗有效。4個系列遞減的內(nèi)毒個系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度分別為素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度分別為0.125，0.25， 0.25和和0.25：20.50.25 根據(jù)公式根據(jù)公式c=lg-1（X/4），則：則： c 在在0.5（0.125EU）至）至2（0.5EU）之間，因此可以用）之間，因此可以用于細菌內(nèi)毒素檢查。于細菌內(nèi)毒素檢查。視頻教學視頻教學鱟試劑靈敏度的復核鱟試劑靈敏度的復核 干擾試驗是為了確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度干擾試驗是為了確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，為產(chǎn)品能否下對內(nèi)

29、毒素和鱟試劑的反應不存在干擾作用，為產(chǎn)品能否用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。 當進行當進行新藥的內(nèi)毒素檢查新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種的品種建立內(nèi)毒素檢查法建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。時，須進行干擾試驗。 當當鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須進行干擾的變化時，須進行干擾試驗。試驗。6、干擾試驗、干擾試驗 分別用分別用BET和供試品溶液（稀釋至和供試品溶液（稀釋至MVD）將）將同一支內(nèi)同一支內(nèi)毒素

30、標準品毒素標準品按下表制備溶液按下表制備溶液A、B、C和和D（共（共36支）。支）。干擾試驗實際上是兩個鱟試劑干擾試驗實際上是兩個鱟試劑靈敏度復核試驗：一個真正的靈敏度復核試驗：一個真正的鱟試劑靈敏度復核；另一個鱟試劑靈敏度復核；另一個“鱟試劑靈敏度復核鱟試劑靈敏度復核”試驗是試驗是用一定濃度的供試品溶液替代用一定濃度的供試品溶液替代BET水（鱟試劑復溶仍采用水（鱟試劑復溶仍采用BET水）水）編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12*4*8*210.50.254444C2/檢查用水檢查用水1248210.50.25

31、4444D無/檢查用水 2 加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，放入生氣泡，放入371恒溫器中，保溫恒溫器中，保溫602分鐘，觀察分鐘，觀察并記錄結(jié)果。并記錄結(jié)果。 結(jié)果判斷：當供試品陰性對照和水陰性對照都為陰性結(jié)果判斷：當供試品陰性對照和水陰性對照都為陰性，并且細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解的內(nèi)毒素系列溶液的結(jié)果，并且細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解的內(nèi)毒素系列溶液的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。在鱟試劑靈敏度復核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。l分別計算用分別計算用BET制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應終點濃度的制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應終點

32、濃度的幾何平均值（幾何平均值（Es）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值（標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Et）Es=lg-1(Xs/4) Et=lg-1(Xt/4)當當Es在在0.5和和2（包括（包括0.5和和2）之間、）之間、Et在在0.5Es至至2Es(包括包括0.5Es和和2Es）之間時，認為供試品在該濃度下無干擾）之間時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。作用。 7、供試品細菌內(nèi)毒素的檢查（凝膠限度試驗）、供試品細菌內(nèi)毒素的檢查（凝膠限度試驗） 按下表制備溶液按下表制備溶液A、B、C和和D。編號編號內(nèi)毒素濃度內(nèi)毒素

33、濃度/配制內(nèi)毒素配制內(nèi)毒素的溶液的溶液平行平行管數(shù)管數(shù)A無無/供試品溶液供試品溶液2供試品溶液供試品溶液B2/供試品溶液供試品溶液2供試品陽性對照供試品陽性對照C2/檢查用水檢查用水2陽性對照陽性對照D無無/檢查用水檢查用水2陰性對照陰性對照 （1）供試品溶液（）供試品溶液（A）的配制）的配制 用用BET水將供試品按照計算的水將供試品按照計算的MVD配成相應濃度的供配成相應濃度的供試品溶液。試品溶液。 （2）陽性對照液（）陽性對照液（C）的配制）的配制 用用BET水將水將CRE制成制成 2濃度的內(nèi)毒素溶液。濃度的內(nèi)毒素溶液。 1010.5EEE0.3ml2.7mlW1.0ml1.0mlW （3

34、）供試品陽性對照液（）供試品陽性對照液（B）的制備）的制備 用被測供試品溶液將用被測供試品溶液將CRE制成制成 2濃度的內(nèi)毒素溶液濃度的內(nèi)毒素溶液。 實際工作中，一般采用實際工作中，一般采用2倍倍MVD的供試品溶液和的供試品溶液和4的內(nèi)毒素溶液等體積混合的方法配制，因此，供試品稀的內(nèi)毒素溶液等體積混合的方法配制，因此，供試品稀釋過程要有釋過程要有2MVD和和MVD兩個濃度，內(nèi)毒素標準品稀釋兩個濃度，內(nèi)毒素標準品稀釋要有要有4和和2兩個濃度。兩個濃度。 例：例：=0.25EU/ml，CRE規(guī)格為規(guī)格為10EU，供試品，供試品MVD=10，如何配制內(nèi)毒素濃度為如何配制內(nèi)毒素濃度為2的供試品陽性對照

35、液？的供試品陽性對照液？ 解解：（：（1）供試品（供試品（S）的稀釋）的稀釋 （2）CRE的稀釋的稀釋0.5ml151 0SSS2.0mlW1.0ml1.0mlW1010.5EEE0.3ml2.7mlW1.0ml1.0mlW配制內(nèi)毒素濃度為配制內(nèi)毒素濃度為2的供試品陽性對照液：的供試品陽性對照液：1.0ml1.0mlS51010.5(S)EE A、B、C、D組（組（8管）加樣結(jié)束后，用封口膜封口，管）加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，放入輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，放入371恒溫器中，恒溫器中，保溫保溫602分鐘，觀察并記錄結(jié)果。分鐘，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果判斷：結(jié)果判斷：

36、當陰性對照溶液當陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，的平行管均為陽性，試驗有效。試驗有效。 若溶液若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；若溶液若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時，溶液復試。復試時，溶液A需做需做4支平行管，若所有平

37、行管均為陰性，支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定；否則判定供試品不符合規(guī)定。判定供試品符合規(guī)定；否則判定供試品不符合規(guī)定。陽性對照結(jié)果出現(xiàn)陰性，可能是由于內(nèi)毒素工作品效價標示陽性對照結(jié)果出現(xiàn)陰性，可能是由于內(nèi)毒素工作品效價標示不準確或效價衰退或失敗、稀釋內(nèi)毒素沒有使用旋渦混合器不準確或效價衰退或失敗、稀釋內(nèi)毒素沒有使用旋渦混合器或稀釋操作不當、鱟試劑效價標示不準確或效價衰退或失效或稀釋操作不當、鱟試劑效價標示不準確或效價衰退或失效、反應試管放入水浴保溫前試管中內(nèi)容物沒有搖勻等造成。、反應試管放入水浴保溫前試管中內(nèi)容物沒有搖勻等造成。陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果可能是由于鱟試劑或者水污染

38、、試驗陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果可能是由于鱟試劑或者水污染、試驗器具污染、試驗過程操作不當污染造成。器具污染、試驗過程操作不當污染造成。 熱原及細菌內(nèi)毒素檢查在保證注射用藥品使用安全方熱原及細菌內(nèi)毒素檢查在保證注射用藥品使用安全方面發(fā)揮著重要的作用。面發(fā)揮著重要的作用。實訓實訓 5%葡萄糖注射液的細葡萄糖注射液的細菌內(nèi)毒素檢查菌內(nèi)毒素檢查試驗原理試驗原理 利用鱟試劑與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的現(xiàn)利用鱟試劑與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的現(xiàn)象，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合象，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。規(guī)定的一種方法。試驗試劑與器具試驗試劑與器具鱟試劑（鱟試劑（=0.25E

39、U/ml）細菌內(nèi)毒素工作標準品細菌內(nèi)毒素工作標準品（CRE，10EU）細菌內(nèi)毒素檢查用水（細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET）5%葡萄糖注射液葡萄糖注射液 旋渦混合器旋渦混合器恒溫水浴器（恒溫水浴器（371）精密移液槍精密移液槍無熱原吸頭（無熱原吸頭（100L、 1mL）安瓿架安瓿架封口膜封口膜脫脂棉和無菌紗布脫脂棉和無菌紗布標簽紙和記號筆標簽紙和記號筆剪刀剪刀表表試驗方法試驗方法 凝膠限度試驗（簡單、經(jīng)濟、應用廣泛，凝膠限度試驗（簡單、經(jīng)濟、應用廣泛，中國藥典中國藥典的的“仲裁仲裁”方法）方法）內(nèi)毒素限值確定內(nèi)毒素限值確定 根據(jù)根據(jù)2010版版中國藥典中國藥典二部二部“葡萄糖注射液葡萄糖注射液”檢查檢查項下項下“細菌內(nèi)毒素細菌內(nèi)毒素”的規(guī)定，其限值（的規(guī)定，其限值（L）為）為0.5EU/ml。最大稀釋倍數(shù)確定最大稀釋倍數(shù)確定 已知：已知：L為為0.5EU/ml，c為為1.0ml/ml，鱟試，鱟試 劑靈敏度劑靈敏度=0.25EU/ml。 MVD=cL/=0.