食品用防腐劑防腐效果測定

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上常用食品用防腐劑對(duì)微生物防腐效果測定公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2008級(jí)本科一班 尹繪權(quán)1 研究背景食品腐敗是影響食品安全的主要因素之一，進(jìn)食污染微生物的食品而引起的食源性疾病已成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題。保證食品的品質(zhì)、延長保存期限、防止食品及原材料的腐敗變質(zhì)、避免損失是食品工業(yè)的重要任務(wù)。一方面，目前為止尚未研制出對(duì)微生物侵染有抵抗力的食品品種，食品中微生物的污染仍將在今后相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)繼續(xù)對(duì)人類健康造成威脅；另一方面，食品生產(chǎn)、加工、流通、制作方式的改變以及食品銷售的異地化等對(duì)食品保質(zhì)期的要求越來越高，因此食品的保鮮與防腐已成為食品加工生產(chǎn)面臨的首要

2、問題，而對(duì)食品防腐劑的選擇和防腐效力的檢測與評(píng)價(jià)已成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋敬螌?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以測定食品中常用的食品防腐劑對(duì)不同微生物的防腐效果為目的，確定防腐劑抑制受試菌生長的最低濃度，即最小抑菌濃度（MIC）。 菌落生長被完全抑制的最低防腐劑濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。根據(jù)受試菌的MIC的大小來確定食物中常用防腐劑對(duì)該種微生物的防腐效果。3 實(shí)驗(yàn)原理食品含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，在物理、化學(xué)和有害微生物等因素的作用下可腐敗變質(zhì)，其中有害微生物是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的主要原因。這些微生物包括：細(xì)菌，主要類群有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門菌等； 酵母，如白色假絲酵母等；

3、 絲狀真菌，主要類群有黑曲霉、黃曲霉、白地霉、島青霉和圓弧青霉等。在食品中常添加的防腐劑有；酸性防腐劑，如苯甲酸、山梨酸和丙酸 (及其鹽 )；酯型防腐劑，無機(jī)防腐劑等。其應(yīng)用范圍和針對(duì)的微生物類群都不盡相同。本實(shí)驗(yàn)以山梨酸為實(shí)驗(yàn)用模式防腐劑，以細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門菌)、酵母(白色假絲酵母)、絲狀真菌(黑曲霉、黃曲霉、白地霉、島青霉和圓弧青霉)為模式微生物，為模式微生物進(jìn)行試驗(yàn)。山梨酸又名花揪酸，生活中常使用山梨酸鉀作為防腐劑對(duì)食物進(jìn)行防腐處理，其對(duì)細(xì)菌、真菌均抑制作用的機(jī)理大致是：在溶液中，弱酸隨 pH不同在解離和未解離狀態(tài)間存在動(dòng)態(tài)平衡。在低pH值情況下該類防腐劑有最大抑

4、菌活性，因?yàn)榇藭r(shí)分子多數(shù)處于未電離狀態(tài)，未電離的有機(jī)弱酸分子是親脂性的，因此可自由透過原生質(zhì)膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，在細(xì)胞內(nèi)接近中性的 pH環(huán)境下，分子解離成帶電質(zhì)子和陰離子，不易透過膜而在細(xì)胞內(nèi)蓄積。防腐劑分子不斷擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞直到達(dá)到平衡，引起細(xì)胞內(nèi)H +的失控，改變細(xì)胞內(nèi) pH狀態(tài)及蓄積毒性陰離子，抑制細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝反應(yīng)，最終達(dá)到抑菌目的。4 實(shí)驗(yàn)材料4.1 菌株本實(shí)驗(yàn)選擇易導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的致病細(xì)菌和真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，在此基礎(chǔ)上，通過預(yù)測和既往資料，增加了對(duì)食品衛(wèi)生質(zhì)量影響較大、并易引起食品污染和食源性疾患的代表性微生物為實(shí)驗(yàn)用菌。1.G+細(xì)菌 金黃色葡萄球菌( Staphylococcus au

5、reus )2.G-細(xì)菌 大腸桿菌( Escherichia coli)、腸炎沙門菌( Salmonella enteritidis )3.酵母 白色假絲酵母/白色念珠菌 ( Candidalbicans)4.絲狀真菌 黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(A. flavas)、白地霉( Geotrichum candidum)、島青霉( Penicillium islandicum)、圓弧青霉( P. cyclopium)4.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基(P otato Dextrose Agar， PDA)4.3 試劑1.滅菌生理鹽水2.防腐劑：選

6、擇食品加工業(yè)中最常用的山梨酸為模式防腐劑4.4 實(shí)驗(yàn)器具生物安全柜，微量移液槍，37攝氏度恒溫箱，27攝氏度恒溫箱等。5 試驗(yàn)方法本試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法將不同濃度的防腐劑混合溶解在瓊脂培養(yǎng)基中，然后點(diǎn)種細(xì)菌，通過細(xì)菌的生長與否，確定防腐劑抑制受試菌生長的最低濃度，即最小抑菌濃度（MIC）。菌落生長被完全抑制的最低防腐劑濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。 菌落生長被完全抑制的最低防腐劑濃度為該樣品對(duì)受試菌的MIC。5.1 防腐劑溶液的配制 以無菌操作取山梨酸鉀10g，分別加入到 90 ml 滅菌磷酸鹽緩沖液中，充分振蕩溶解，配制成 10%均勻分散的溶液或懸濁液，并用滅菌磷酸鹽緩沖液依次稀釋成質(zhì)量百分濃

7、度為 2%， 1.5%， 1.2%， 1%，0.9%， 0.8%， 0.7%， 0.6%， 0.5%， 0.4%， 0.3%， 0.2%， 0.1%， 0.09%，0.08% ， 0.07% ， 0.06% ， 0.05% ， 0.04% ， 0.03% ， 0.02% ， 0.01% ，0.005%的稀釋液（該濃度可以通過預(yù)先實(shí)驗(yàn)測得），置4550 水浴備用。5.2 培養(yǎng)基的配制分別配制單倍濃度和雙倍濃度MH 瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌用）和SDA 培養(yǎng)基（真菌用）。5.3 含防腐劑培養(yǎng)基的配制分別取10 ml 5.1節(jié)中稀釋的防腐劑溶液加入平皿內(nèi)，將雙倍濃度 MH 瓊脂 10 ml 加入平皿內(nèi)，邊加

8、邊搖晃平板，使防腐劑溶液和培養(yǎng)基充分混勻；再分別取 10 ml 5.1 節(jié)中稀釋的防腐劑溶液加入平皿內(nèi)，將雙倍濃度SDA 培養(yǎng)基 10 ml 加入平皿內(nèi)，邊加邊搖晃平板，使防腐劑溶液和培養(yǎng)基充分混勻。配制好的培養(yǎng)基中含防腐劑濃度分別為10.00、7.50、6.00、5.00、4.50 、4 .00、3.50 、3.00、2.50 、2.00、1.50、1.00 、0.50 、0.45、0.40、0.35 、0.30 、0.25 、0.20、0.15 、0.10、0.05、0.025 mg/m。5.4 加樣用微量移液器取 2 l（含菌量約為 107cfu/ml）菌懸液點(diǎn)種于含防腐劑培養(yǎng)基的平板上

9、，接種后所形成的菌液圈直徑約58 mm。以同樣方法接種不含防腐劑的單倍濃度的MH瓊脂平板和SDA 平板，作為陽性對(duì)照。5.5 培養(yǎng)將接種后的細(xì)菌平板放置 37 培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果；真菌平板放置28 培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。6 預(yù)期結(jié)果列表比較各種微生物的MIC值的大小 單位（mg/ml）G+菌G-菌酵母絲狀真菌金黃色葡萄球菌大腸桿菌腸炎沙門菌白色假絲酵母黑曲霉黃曲霉白地霉島青霉圓弧青霉MIC值根據(jù)文獻(xiàn)所查結(jié)果可知：山梨酸無論是對(duì)細(xì)菌還是真菌均有較強(qiáng)的抑制作用，而且山梨酸對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于絲狀真菌和酵母。故細(xì)菌的MIC值應(yīng)該小于酵母和絲狀真菌。7 結(jié)果討論與分析

10、7.1 實(shí)驗(yàn)用菌種在食品防腐劑防腐效果評(píng)價(jià)時(shí)微生物的選擇至關(guān)重要，一般應(yīng)包括革蘭陰性細(xì)菌、革蘭陽性細(xì)菌、霉菌和酵母中的至少一種。本次試驗(yàn)分別選擇了革蘭陽性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌、絲狀真菌和酵母中的代表性菌種為受試微生物，這一組合基本滿足了防腐劑效果評(píng)價(jià)對(duì)微生物的綜合要求。其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉和白色念珠菌，是食品中常見的腐敗微生物，具有明顯的實(shí)驗(yàn)意義。此外還增加了從食品中分離、易導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的其他細(xì)菌和真菌，從而使對(duì)防腐劑防腐效果的評(píng)價(jià)更接近現(xiàn)實(shí)。7.2 受試微生物濃度的選擇 每種防腐劑均有一定的抑菌范圍，且其抑菌效果與食品中污染的微生物種類和污染程度密切相關(guān)。食品染菌情況愈重，

11、防腐效果就越差，如果食品已腐敗變質(zhì)，任何防腐劑都無濟(jì)于事。因此受試微生物的濃度是影響食品防腐劑防腐作用的重要因素。經(jīng)文獻(xiàn)查知，大多數(shù)研究以細(xì)菌培養(yǎng)24h、真菌培養(yǎng)57天、酵母菌培養(yǎng)2448h 的培養(yǎng)物稀釋到 10- 4(約相當(dāng)于105cfu/ml)為實(shí)驗(yàn)用菌濃度。這一稀釋度有一定的科學(xué)性，但不夠準(zhǔn)確。為此若需改進(jìn)此點(diǎn)，較為合理的方法可以使用分光光度計(jì)測定細(xì)菌濃度后再進(jìn)行試驗(yàn)。7.3 實(shí)驗(yàn)用防腐劑及其濃度的選擇對(duì)于不同的食品，由于其基質(zhì)成分、來源、屬性、加工方式不同，因此污染的優(yōu)勢微生物類別各異。各種食品防腐劑對(duì)不同類別微生物的抑制或殺滅能力差別較大，因此實(shí)際工作中對(duì)具體使用的食品防腐劑種類和濃度的選擇應(yīng)根據(jù)食品屬性、工藝條件、防腐劑性質(zhì)、防腐劑間的相互作用等特點(diǎn)來確定。本實(shí)驗(yàn)選用食品加工業(yè)中最常用的山梨酸為模式防腐劑，實(shí)驗(yàn)用濃度均在 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) G B 中規(guī)定的各類食品使用范圍內(nèi)，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近實(shí)際，有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性和正確性進(jìn)行科學(xué)評(píng)估。參考文獻(xiàn)1. 李鳳琴，李玉偉，王曄茹，董銀萍，羅雪云，王竹天，食品用防腐劑防腐效果測定和評(píng)價(jià)程序研究，衛(wèi)生研究雜志2009.112. 鄭萍，陳西平, 化妝品中污染微生物對(duì)常用防腐劑的抵抗性, 環(huán)境與健康雜志2009.83. 孟哲，劉榮琴