證明線粒體的電子傳遞和氧化磷酸化是由兩個不同的結(jié)構(gòu)

1、證明線粒體的電子傳遞和氧化磷酸化是由兩2個不同的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)來實現(xiàn)的生物工程學(xué)院021班向生光前言 三羧酸循環(huán)等呼吸代謝過程中脫下的氫被NAD+或FAD所接受。細(xì)胞內(nèi)的輔酶或輔基數(shù)量是有限的，它們必須將氫交給其它受體之后，才能再次接受氫。在需氧生物中，氧氣便是這些氫的最終受體。這種有機物在生物活細(xì)胞中所進行的一系列傳遞氫和電子的氧化還原過程，稱為生物氧化(biological oxidation)。生物氧化與非生物氧化的化學(xué)本質(zhì)是相同的，都是脫氫、失去電子或與氧直接化合，并產(chǎn)生能量。然而生物氧化與非生物氧化不同，它是在生活細(xì)胞內(nèi)，在常溫、常壓、接近中性的pH和有水的環(huán)境下，在一系列的酶以及中間傳遞

2、體的共同作用下逐步地完成的，而且能量是逐步釋放的。生物氧化過程中釋放的能量可被偶聯(lián)的磷酸化反應(yīng)所利用，貯存在高能磷酸化合物（如ATP、GTP等）中，以滿足需能生理過程的需要。概念v電子傳遞過程包括包括電子從還原型輔酶通過一系列按照電子親和力遞增順序排列的電子載體所構(gòu)成的電子傳遞到氧的過程。v氧化磷酸化作用指的是伴隨電子從底物到氧的傳遞，ADP被磷酸化形成ATP的酶促過程。氧化磷酸化的機理v在電子傳遞過程中所釋放出的自由能是怎樣轉(zhuǎn)入ATP分子中的， 這就是氧化磷酸化作用的機理問題。有多種假說，如化學(xué)偶聯(lián)學(xué)說、化學(xué)滲透學(xué)說和構(gòu)象學(xué)說。不過，目前為大家所公認(rèn)的、實驗證據(jù)較充足的是英國生物化學(xué)家米切爾

3、的化學(xué)滲透學(xué)說。 經(jīng)典實驗 1968年E.Racker等人用超聲波將線粒體破碎，線粒體內(nèi)膜碎可自然卷成顆粒朝外的小膜泡，這種小膜泡稱為亞線粒體小泡（submitochondrial vesicle）或亞線粒體顆粒（submitochodrial particles）。這些亞線粒體小泡具有電子傳遞和磷酸化的功能。如用胰蛋白酶或尿素處理，則小泡外面的顆?？山怆x下來，這樣的小泡便只能進行電子傳遞，而不能使ADP磷酸化生成ATP。 如果將這些顆粒重新裝配到無顆粒的小泡上時，則小泡又恢復(fù)了電子傳遞和磷酸化相偶聯(lián)的能力。由此可見，由NADH脫氫酶至細(xì)胞色素氧化酶的整個呼吸鏈的各種組分均存在于線粒體內(nèi)膜中，

4、而顆粒是氧化磷酸化的偶聯(lián)因子，位于內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)，它是基粒（ATP酶復(fù)合物）的組分之一。氧化磷酸化的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)v電子傳遞鏈vATP合成酶的分子結(jié)構(gòu)與組成v氧化磷酸化作用與電子傳遞的偶聯(lián)v氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑結(jié)論 從以上各方面可以得知，線粒體的電子傳遞是由電子傳遞鏈來實現(xiàn)的，而氧化磷酸化也就是ATP的合成是在ATP合成酶中完成的。二者是偶聯(lián)的卻又是相對獨立的。從而說明電子傳遞和氧化磷酸化是由兩個不同的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)來實現(xiàn)的。電子傳遞鏈v所謂呼吸鏈(respiratory chain)即呼吸電子傳遞鏈(electron transport chain)，是線粒體內(nèi)膜上

5、由呼吸傳遞體組成的電子傳遞總軌道。呼吸鏈傳遞體能把代謝物脫下的電子有序地傳遞給氧，呼吸傳遞體有兩大類：氫傳遞體與電子傳遞體。氫傳遞體包括一些脫氫酶的輔助因子，主要有NAD、FMN、FAD、UQ等。它們既傳遞電子，也傳遞質(zhì)子；電子傳遞體包括細(xì)胞色素系統(tǒng)和某些黃素蛋白、鐵硫蛋白。呼吸鏈傳遞體傳遞電子的順序是：代謝物NAD+FADUQ細(xì)胞色素系統(tǒng)O2。電子傳遞鏈的組成v復(fù)合體Iv輔酶Qv復(fù)合體IIv復(fù)合體IIIv細(xì)胞色素cv復(fù)合體IV化學(xué)滲透假說v1.1.呼吸傳遞體不對稱地分布在線粒體內(nèi)膜上呼吸傳遞體不對稱地分布在線粒體內(nèi)膜上 呼吸鏈上的遞氫體與電子傳遞體在線粒體內(nèi)膜上有著特定的不對稱分布，彼此相間

6、排列，定向傳遞。v2.2.呼吸鏈的復(fù)合體中的遞氫體有質(zhì)子泵的作用呼吸鏈的復(fù)合體中的遞氫體有質(zhì)子泵的作用 它可以將H+從線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)泵至外側(cè)。一般來說一對電子從NADH傳遞到O2時,共泵出6個H+。從FADH2開始,則共泵出4個H+。膜外側(cè)的H+,不能自由通過內(nèi)膜而返回內(nèi)側(cè),這樣在電子傳遞過程中，在內(nèi)膜兩側(cè)建立起質(zhì)子濃度梯度(pH)和膜電勢差(E),二者構(gòu)成跨膜的H+電化學(xué)勢梯度H+，若將H+轉(zhuǎn)變?yōu)橐噪妱軻為單位，則為質(zhì)子動力。v質(zhì)子的濃度梯度越大，則質(zhì)子動力就越大，用于合成ATP的能力越強。v3.3.由質(zhì)子動力推動由質(zhì)子動力推動ATPATP的合成的合成 質(zhì)子動力使H+流沿著ATP酶（偶聯(lián)因

7、子）的H+通道進入線粒體基質(zhì)時，釋放的自由能推動ADP和Pi合成ATP（圖片）。v化學(xué)滲透學(xué)說已得到充足的實驗證據(jù)。當(dāng)把線粒體懸浮在無O2緩沖液中,通入O2時，介質(zhì)很快酸化，跨膜的H+濃度差可以達(dá)到1.5pH單位，電勢差達(dá)0.5V，內(nèi)膜的外表面對內(nèi)表面是正的,并保持相對穩(wěn)定，證實內(nèi)膜不允許外側(cè)的H+滲漏回內(nèi)膜內(nèi)側(cè)。但當(dāng)加入化學(xué)滲透假說解偶聯(lián)劑2,4-二硝基苯酚(DNP)時，跨膜的H+濃度差和電勢差就不能形成，就會阻止ATP的產(chǎn)生。有人將嗜鹽菌的紫膜蛋白和線粒體ATPase嵌入脂質(zhì)體,懸浮在含ADP和Pi溶液中，在光照下紫膜蛋白從介質(zhì)中攝取H+，產(chǎn)生跨膜的H+濃度差，推動ATP的合成。當(dāng)人工建立

8、起跨內(nèi)膜的合適的H+濃度差時，也發(fā)現(xiàn)ADP和Pi合成了ATP。線粒體中氧化磷酸化反應(yīng)的一般機理線粒體中氧化磷酸化反應(yīng)的一般機理1.復(fù)合體復(fù)合體 v又稱NADH泛醌氧化還原酶(NADHubiquinone oxidoreductase)。 分子量700X103900X103,含有25種不同的蛋白質(zhì),包括以黃素單核苷酸(flav in mononucleotide,FMN)為輔基的黃素蛋白和多種鐵硫蛋白，如水溶性的鐵硫蛋白(iron sulfur protein,IP)、鐵硫黃素蛋白(ironsulfur flavoprotein，F(xiàn)P)、泛醌(ubiquinone,UQ)、磷脂(phosphol

9、ipid)。復(fù)合體的功能在于催化位于線粒體基質(zhì)中由TCA循環(huán)產(chǎn)生的NADHH中的2個H經(jīng)FMN轉(zhuǎn)運到膜間空間，同時再經(jīng)過Fe-S將2個電子傳遞到UQ(又稱輔酶Q,CoQ)；UQ再與基質(zhì)中的H結(jié)合，生成還原型泛醌(ubiquinol,UQH2)。該酶的作用可為魚藤酮(rotenone)、殺粉蝶菌素A(piericidin A)、巴比妥酸(barbital acid)所抑制。它們都作用于同一區(qū)域，都能抑制Fe-S簇的氧化和泛醌的還原。 2.復(fù)合體復(fù)合體 又稱琥珀酸，泛醌氧化還原酶(succinateubiquinone oxidoreductase)分子量約140103，含有45種不同的蛋白質(zhì)，主

10、要成分是琥珀酸脫氫酶(succinate dehydro genase,SDH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)、細(xì)胞色素b(cytochrome b)和3個Fe-S蛋白。復(fù)合體的功能是催化琥珀酸氧化為延胡索酸，并將H轉(zhuǎn)移到FAD生成FADH2，然后再把H轉(zhuǎn)移到UQ生成UQH2。該酶活性可被2-噻吩甲酰三氟丙酮(thenoyltrifluoroacetone,TTFA)所抑制。 3.復(fù)合體復(fù)合體 v又 稱 U Q H2 細(xì) 胞 色 素 C 氧 化 還 原 酶(ubiquinonecytochrome c oxidoreductase),分

11、子量250103，含有910種不同蛋白質(zhì)，一般都含有2個Cyt b，1個Fe-S蛋白和1個Cyt c1。復(fù)合體的功能是催化電子從UQH2經(jīng)Cyt bFeSCytc1傳遞到Cyt c，這一反應(yīng)與跨膜質(zhì)子轉(zhuǎn)移相偶聯(lián)，即將2個H釋放到膜間空間。也有人認(rèn)為在電子從Fe-S傳到Cyt c1之前，先傳遞給UQ，同時UQ與基質(zhì)中的H+結(jié)合生成UQH2。UQH2再將電子傳給Cytc1，同時將2個H+釋放到膜間空間。泛醌線粒體復(fù)合物泛醌線粒體復(fù)合物（細(xì)胞色素（細(xì)胞色素c 氧化還原酶）的假想構(gòu)成和膜局部構(gòu)造氧化還原酶）的假想構(gòu)成和膜局部構(gòu)造4.復(fù)合體復(fù)合體 又稱Cyt c細(xì)胞色素氧化酶(Cyt ccytochro

12、me oxidase)分子量約160170103，含有多種不同的蛋白質(zhì)，主要成分是Cyta和Cyta3及2個銅原子，組成兩個氧化還原中心即Cyta CuA和Cyta3 CuB，第一個中心是接受來自Cyt c 的電子受體，第二個中心是氧還原的位置。它們通過Cu+ Cu2+的變化，在Cyta和Cyta3間傳遞電子。其功能是將 Cyt c中的電子傳遞給分子氧，氧分子被Cyta3、CuB還原至過氧化物水平；然后接受第三個電子，O-O鍵斷裂，其中一個氧原子還原成H2O；在另一步中接受第四個電子，第二個氧原子進一步還原。也可能在這一電子傳遞過程中將線粒體基質(zhì)中的 2個H+轉(zhuǎn)運到膜間空間。CO、氰化物(cy

13、anide,CN-)、疊氮化物(azide,N3-)同O2競爭與Cytaa3中Fe的結(jié)合，可抑制從Cytaa3到O2的電子傳遞。線粒體復(fù)合物線粒體復(fù)合物（細(xì)胞色素（細(xì)胞色素c氧化酶）的假想結(jié)構(gòu)和膜局部結(jié)構(gòu)氧化酶）的假想結(jié)構(gòu)和膜局部結(jié)構(gòu)電子傳遞的方向（圖片） 黃素蛋白中的FADH2 琥珀酸-Q還原酶 NADNADH-QQ細(xì)胞色素細(xì)胞色素c 還原酶 還原酶細(xì)胞色素氧化酶氧 圖圖 5-11 植物線粒體內(nèi)膜上的復(fù)合體及其電子傳遞植物線粒體內(nèi)膜上的復(fù)合體及其電子傳遞、分別代表復(fù)合體、； UQ庫代表存在于線粒體中的泛醌庫ATP合成酶vadenosine triphosphate synthase，又叫H+

14、-ATP酶復(fù)合物。由8種不同亞基組成,分子量分別是8.210355.2103，它們又分別組成兩個蛋白質(zhì)復(fù)合體(F1-F0)。F1從內(nèi)膜伸入基質(zhì)中，突出于膜表面，具有親水性，酶的催化部位就位于其中。F0疏水，嵌入內(nèi)膜磷脂之中，內(nèi)有質(zhì)子通道，它利用呼吸鏈上復(fù)合體、運行產(chǎn)生的質(zhì)子能，將ADP和Pi合成ATP，也能催化與質(zhì)子從內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)向內(nèi)膜外側(cè)轉(zhuǎn)移相聯(lián)的ATP水解。圖圖 5-14 ATP生成過程中構(gòu)造變化的模型。生成過程中構(gòu)造變化的模型。F1復(fù)合物有三個核苷酸結(jié)合位點。每一部位有三種完全不同的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。松散的核苷酸結(jié)合部位（L），緊密核苷酸結(jié)合部位（T）和開放核苷酸結(jié)合部位（O）。在任何時候。F1復(fù)

15、合物包括這三種不同的結(jié)構(gòu)，其中有一個與酶復(fù)合物的每一個催化中心相連。ADP和Pi開始被結(jié)合到開放狀態(tài)未被占有的部位（1）。質(zhì)子運動通過F0釋放能量引起亞單位旋轉(zhuǎn)。這種旋轉(zhuǎn)自發(fā)改變了三個核苷酸結(jié)合位點的構(gòu)造。結(jié)合有ATP的T型被轉(zhuǎn)變成O型，ATP被釋放出來。同時，結(jié)合有ADP和Pi的L型被轉(zhuǎn)化成T型，疏水性的結(jié)合正有利于ATP生成。第上步中結(jié)合ADP和Pi的開放部位轉(zhuǎn)化或松散型結(jié)構(gòu)（2）。被緊密結(jié)合的ADP和Pi轉(zhuǎn)化生成ATP，此步驟不需消耗能量和構(gòu)型改變（3）氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑1.解偶聯(lián)劑解偶聯(lián)劑(uncoupler) 2.2.抑制劑抑制劑( (depre

16、ssant) depressant) 3.3.離子載體抑制劑離子載體抑制劑( (ionophore depressant)ionophore depressant)1.1.解偶聯(lián)劑解偶聯(lián)劑( (uncoupler) uncoupler) v植物在遇到干旱或某些化學(xué)物質(zhì)作用時，會抑制ADP形成ATP的磷酸化作用，但不抑制電子傳遞，使電子傳遞產(chǎn)生的自由能以熱的形式散失掉,導(dǎo)致氧化過程與磷酸化作用不偶聯(lián),這就是氧化磷酸化解偶聯(lián)現(xiàn)象。能對呼吸鏈產(chǎn)生氧化磷酸化解偶聯(lián)作用的化學(xué)試劑叫解偶聯(lián)劑。最常見的解偶聯(lián)劑有DNP，含有一個酸性基團的DNP是脂溶性的，可以穿透線粒體內(nèi)膜，并把一個H+從膜外帶入膜內(nèi)，從而

17、破壞了跨內(nèi)膜的質(zhì)子梯度，抑制了ATP的生成。解偶聯(lián)時會促進電子傳遞的進行，O2的消耗加大。2.2.抑制劑抑制劑( (depressant) depressant) v抑制劑與解偶聯(lián)劑的區(qū)別在于,這類試劑不僅抑制ATP的形成，還同時抑制O2的消耗。這是因為像寡霉素(oligomycin)這一類的化學(xué)物質(zhì)可以阻止膜間空間中的H+通過ATP合成酶的Fo進入線粒體基質(zhì)，這樣不僅會阻止ATP生成，還會維持和加強質(zhì)子動力勢,對電子傳遞產(chǎn)生反饋抑制,O2的消耗就會相應(yīng)減少。 3.3.離子載體抑制劑離子載體抑制劑( (ionophore ionophore depressant)depressant)v離子載

18、體抑制劑與解偶聯(lián)劑的區(qū)別在于它不是H+載體，而是可能和某些陽離子結(jié)合，生成脂溶性的復(fù)合物，并作為離子載體使這些離子能夠穿過內(nèi)膜，這樣就增大了內(nèi)膜對某些陽離子的通透性；同時因為在轉(zhuǎn)運陽離子到基質(zhì)中時消耗了自由能，降低了質(zhì)子動力，從而抑制了ATP的形成。例如纈氨霉素(valinomycin)與K形成的復(fù)合物較易通過內(nèi)膜進入基質(zhì)，會抑制氧化磷酸化過程。氧化磷酸化作用與電子傳遞的偶聯(lián) 氧化還原的本質(zhì)是電子的轉(zhuǎn)移。氫原子的轉(zhuǎn)移其本質(zhì)也是電子轉(zhuǎn)移，因為H原子可分解為H+ 與e- 。當(dāng)電子從NADH或FADH2 經(jīng)呼吸鏈傳遞給氧形成水時，同時伴有ADP磷酸化形成ATP，這一過程稱為氧化磷酸化。氧化磷酸化是生成ATP的一種主要方式，是細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換的主要環(huán)節(jié)。實驗證明，呼吸鏈中有3個部位的自由能變化較大，這3個部位是呼吸鏈中氧化還原十分哪個的能量與ADP磷酸化生成的偶聯(lián)部位，也即是呼吸鏈上可被特異性抑制劑阻斷的部位。NADH呼吸鏈生成ATP 的3個部位是：NADH至輔酶Q；細(xì)胞色素b至細(xì)胞色素c；細(xì)胞色素aa3 至氧之間。3處各生成一分子ATP，共生成3個ATP分子。但FADH2 呼吸鏈只生成2個ATP分子，這是因為電子從FADH2 至輔酶Q間傳遞所釋放的能量不足形成高能磷酸鍵所致。輔酶Q 輔酶Q（CoQ）又稱泛醌，有時簡稱為Q。是脂溶性輔酶。在線粒體內(nèi)膜中是一種均