網(wǎng)織血小板檢測方法的改良及臨床應(yīng)用

1、網(wǎng)織血小板檢測方法的改良及臨床應(yīng)用        【關(guān)鍵詞】 血小板減少;,網(wǎng)織血小板;,流式細胞術(shù) 摘要目的 改良網(wǎng)織血小板（RP）檢測方法并探討其臨床應(yīng)用價值。方法 以噻唑橙（TO）作為RNA的熒光染料，利用流式細胞儀檢測30例正常人（正常對照組）和48例各種血小板減少癥外周血中含有RNA的RP百分數(shù)及RP            【關(guān)鍵詞】  血小板減少;,網(wǎng)織血小板;,流式細胞術(shù)

2、摘要目的 改良網(wǎng)織血小板（RP）檢測方法并探討其臨床應(yīng)用價值。方法 以噻唑橙（TO）作為RNA的熒光染料，利用流式細胞儀檢測30例正常人（正常對照組）和48例各種血小板減少癥外周血中含有RNA的RP百分數(shù)及RP絕對值，后者包括原發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）、再生障礙性貧血病人（AA）及初治急性白血病病人。結(jié)果 ITP病人RP百分數(shù)明顯高于正常對照組（ F=65.29，q=10.26，P <0.01），而RP絕對值明顯低于正常對照組（ F=85.07，q=19.59，P <0.01）;AA病人RP百分數(shù)及絕對值均低于正常對照組（ q=3.47、16.41，P <0.05、 0

3、.01 ）;AL組病人RP百分數(shù)與正常對照組比較無明顯差異（ q=0.51，P >0.05），但其RP絕對值明顯低于正常對照組（ q=15.46，P <0.01）。結(jié)論 改良了傳統(tǒng)的網(wǎng)織血小板檢測方法并建立了簡便、穩(wěn)定的檢測手段，為臨床各類血小板減少性疾病的診斷提供了可靠的方法。 關(guān)鍵詞 血小板減少; 網(wǎng)織血小板; 流式細胞術(shù) ABSTRACTObjectiveTo improve the measurement of reticulated platelets （RPs） and to explore its clinical application. MethodsUsing

4、thiazole orange as a fluorescent dye， RPs were measured by analyzing the RNA content in platelets in 30 normal controls and 48 various thrombocytopenia， i.e. idiopathic thrombocytopenic purpura （ITP）， aplastic anemia （AA）， and initially-treated acute leukemia （AL）， with flow cytometry. The percentag

5、e and absolute value of RPs were calculated. ResultsCom-pared with the normal group， ITP patients had a significantly high percentage （ F=65.29，q=10.26，P< 0.01） and low absolute value of RPs （ F=85.07，q=19.59，P <0.01）; in AA， both the percentage and absolute value of RPs were at low levels （ q

6、=3.47，16.41; P <0.05，0.01）. There was no difference of RP percentage between the AL and normal controls （ q= 0.51， P >0.05）， but the absolute value of RPs in AL was significantly lower than the control （ q=15.46， P <0.01）. ConclusionThe traditional method of reticulated platelet detection h

7、as been improved and a simple and stable one established， which provides a reliable method for diagnosis of various thrombocytopenia.  KEY WORDSthrombocytopenia; reticulated platelet; flow cytometry 網(wǎng)織血小板（RP）與網(wǎng)織紅細胞一樣都是剛從骨髓中釋放出來的未成熟細胞1，RP與正常血小板相比胞漿內(nèi)含有少量mRNA，體積較大，而且有更強的活性2。隨著血小板的成熟，胞漿內(nèi)mRNA逐漸消失，體積

8、逐漸變小。測定外周血RP可以比較精確地反映骨髓血小板生成情況。熒光染料噻唑橙（TO）可以直接穿過細胞膜進入胞漿，當它與RNA結(jié)合后，其發(fā)射熒光強度的能力可增大3 000倍。我們對檢測方法進行了改良并探討外周血RP數(shù)值的變化在各型血小板減少性疾病中的診斷價值，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。 1 資料與方法  1.1 研究對象 我院20032004年住院血液病病人48例，其中特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）21例，再生障礙性貧血（AA）15例，白血病初治病人（AL）12例，診斷均符合血液病診斷及療效標準3。正常對照組為正常健康人30例，為我院門診體檢者，男14例，女16例;年齡1672歲;血小板計數(shù)

9、（100300）×109 /L。 1.2 試劑與儀器 TO購自美國Sigma公司，CD41-PE試劑盒為法國Immuno-teach產(chǎn)品。EPICSXL型流式細胞儀為Coulter公司生產(chǎn)，應(yīng)用SYSTEM Software獲取和分析試驗數(shù)據(jù)，鞘液使用ISOTON 稀釋液。Coulter-ONYX型血細胞計數(shù)儀為美國Coul-ter公司生產(chǎn)。 1.3 富血小板血漿（PRP）制備及標記 采病人靜脈血2 mL，500 r/min離心5 min，取上清，加入TES，2 000 r/min離心10 min，棄上清，制成PRP。取FCM專用試管兩支，每支試管中加入15 L PRP，50 L P

10、BS和 10 L CD41-PE單抗，標記血小板，漩渦混勻后室溫避光孵育20 min后，分別在對照管中加入1 mL PBS，測定管中加入TO試劑（20 g/L）1 mL，再次室溫孵育30 min。 1.4 檢測方法改良 由于使用的TO試劑的濃度和孵育時間及設(shè)定的Mark（陰陽性的界線）的不同，對檢測的結(jié)果有很大的影響，故對TO試劑進行了一系列不同濃度的稀釋，并進行了檢測標本的比較，以確定TO試劑的測定的最佳濃度。將TO溶于甲醇，使其終濃度為1 g/L，-20 保存作為儲存液備用，PBS配成濃度為20 g/L應(yīng)用液，可保存1周，結(jié)果穩(wěn)定。參照MATIC等4描述的設(shè)門策略識別網(wǎng)織血小板，F(xiàn)SLOG

11、為 X 軸，對數(shù)CD41-PE為 Y 軸，設(shè)CD41陽性細胞為A門，另開一窗以SSLOG為 X 軸，對數(shù)（TO-Retic）為 Y 軸，對A門中的血小板進行分析，以自身血小板為陰性對照，沿血小板實際點圖上緣設(shè)立界值，使其RP百分數(shù)在1%以下，檢測標本與自身對照試驗條件完全一致。流式細胞儀檢測20 000個血小板，RP結(jié)果以百分數(shù)表示，RP絕對值為血小板數(shù)乘以RP百分數(shù)。 1.5 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)均以 x±s 表示，組間比較采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析。 2 結(jié)果  正常對照組、ITP組、AA組、AL組RP絕對值分別為（18.16±6.60）×109

12、 /L、（8.98±3.09）×109 /L、（1.84±0.75）×109 /L、（1.54±0.48）×109 /L，RP百分數(shù)分別為（7.38±3.51）%、（7.38± 3.51 ）%、（ 4.71± 1.32）%、（6.51±1.47）%。ITP病人RP百分數(shù)明顯高于正常對照組（ F=65.29， q= 10.26，P <0.01），而RP絕對值明顯低于正常對照組（ F= 85.07，q=19.59，P <0.01）;AA病人RP百分數(shù)及絕對值均低于正常對照組（ q=3.4

13、7、 16.41 ， P < 0.05、0.01）;AL組病人RP百分數(shù)與正常對照組比較無明顯差異（ q=0.51，P >0.05），但其RP絕對值明顯低于正常對照組（ q=15.46，P <0.01）。 3 討論  由于RP是剛從骨髓釋放出來的未成熟血小板，它可以像檢測網(wǎng)織紅細胞反映骨髓紅系的造血情況一樣，用來鑒別血小板減少性疾病和監(jiān)測治療后的骨髓造血情況。血小板減少癥為常見血液病，了解血小板的生成情況對血小板減少癥發(fā)病機制（生成減少、破壞過多和分布異常等）的判斷極為重要。目前臨床上主要通過骨髓穿刺涂片，觀察MK的數(shù)量及成熟情況來作為依據(jù)，因受取材、制片

14、及操作者個人主觀因素的影響，結(jié)果常有一定的偏差;且反復(fù)穿刺給病人帶來較大痛苦，病人常難以接受，或者通過血小板特異性抗體檢測5，間接觀察血小板破壞情況。傳統(tǒng)的RP檢測靠顯微鏡目視計數(shù)，費時費力，尤其在血小板減少時更難，從而影響了RP測定的開展和應(yīng)用，而外周血RP能反映骨髓MK生成血小板的情況。1990年KIENAST等6用TO作為RNA的熒光染色，運用流式細胞儀開創(chuàng)了網(wǎng)織血小板的自動化計數(shù)，隨后有許多作者在此基礎(chǔ)上進行改良。本實驗以富含血小板血漿代替全血，避免了網(wǎng)織紅細胞的熒光干擾，使RP測定的準確性大大提高。同時，應(yīng)用血小板特異性單抗CD41-PE結(jié)合血小板，在流式細胞儀檢測中可以準確進行血小

15、板定位，克服較大血小板、殘余紅細胞及細胞碎片的干擾。不同的作者使用的檢測方法中，TO濃度選擇201 000 g/L，孵育時間15 min 2.5 h 。實驗中我們發(fā)現(xiàn)在TO溶液中孵育的血小板隨TO濃度的增加和孵育時間的增加呈非飽和地增加，這可能與TO的親脂性有關(guān)。血小板有非特異性濃集TO的能力，因此本研究選擇自身血小板作為陰性對照，在較低濃度TO（20 g/L），較短孵育時間（共50 min）進行，以保證良好的精密度，確保實驗結(jié)果穩(wěn)定。目前國際專家小組正在努力使RP的檢測方法進一步標準化。在這之前，各個實驗室應(yīng)該建立自己的正常參考值，以達到對臨床的輔助診斷目的，本結(jié)果RP百分數(shù)為（7.38&#

16、177;3.51）%，與國內(nèi)報道結(jié)果相近7。本研究結(jié)果顯示，不同原因引起的血小板減少性疾病，其RP百分數(shù)及絕對值不同。ITP病人RP百分數(shù)顯著高于正常對照組，說明由于外周血小板過度破壞，引起骨髓內(nèi)MK代償性增生，致MK數(shù)增多，釋放至外周血的新生血小板增多，從而RP百分數(shù)增高;但由于外周血小板破壞速度超過骨髓MK生成血小板速度，使外周血小板明顯減少， 故RP絕對值顯著低于正常。在AL、AA病人，其病 因是由于各種原因引起骨髓內(nèi)MK受抑，產(chǎn)生及釋放至外周的血小板顯著減少，RP百分數(shù)在AA低于正常組，AL變化不明顯，而RP絕對值明顯低于正常。由此可見，測定外周血RP有助于區(qū)分外周 血小板減少是由于血

17、小板生成減少或破壞過多所致。綜上所述，通過對傳統(tǒng)的RP檢測方法的改良，建立一簡便、穩(wěn)定、適用于臨床的檢測手段，可為臨床各類血小板減少性疾病的診斷提供可靠方法。     參考文獻 1 AULTK A， KNOWLES C. In vivo biotinylation demonstrates that reticulated platelets are the youngest platelets in circula- tionJ. Exp Hematol， 1995，23:996-1001. 2 PENG J，   

18、60;        參考文獻 1 AULTK A， KNOWLES C. In vivo biotinylation demonstrates that reticulated platelets are the youngest platelets in circula- tionJ. Exp Hematol， 1995，23:996-1001.  2 PENG J， FRIESE P， HEILMANN E， et al. Aged platelets have an impaired response to thrombin as quantitated by P-se-lect