阿司匹林對(duì)大鼠脊髓損傷細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

1、阿司匹林對(duì)大鼠脊髓損傷細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 作者：王景，夏亞一，李延宏，潘文杰，趙斌 【摘要】 目的 觀察阿司匹林對(duì)大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法 選擇65只體重為220250 g的Wistar大鼠(雌雄不限)，于T10部位置入后路漸進(jìn)式壓迫裝置，制作成慢性壓迫性脊髓損傷模型。隨機(jī)分為阿司匹林治療組(A組，30只)、生理鹽水對(duì)照組(B組，30只)和假手術(shù)組(C組，5只)。應(yīng)用原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP標(biāo)記技術(shù)，分別于慢性壓迫性脊髓損傷后1、3、7、14、28 d做行為學(xué)評(píng)價(jià)，并取材對(duì)脊髓損傷區(qū)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。結(jié)果 A、B組均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，A組與B組

2、細(xì)胞凋亡率相比差異有顯著性(P0.05)，A組與B組行為學(xué)評(píng)價(jià)相比差異有顯著性(P0.05)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況與運(yùn)動(dòng)功能改變具有相關(guān)性。結(jié)論 阿司匹林對(duì)慢性脊髓壓迫損傷后所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用。 【關(guān)鍵詞】 阿司匹林；慢性壓迫；脊髓損傷；神經(jīng)保護(hù)；細(xì)胞凋亡 Neuroprotection Effect of Aspirin on Neuron Apoptosis Following Chronic Spinal Cord Compressive Injury in Rats Abstract：Objective This study evaluated the neuroprotec

3、tion effect of aspirin on neuron apoptosis following chronic spinal cord compressive injury in rats.Methods The chronic spinal cord compression model made of 65 Wistar mice(Weight 220250 g) were assigned into the following 4 groups randomly.30 mice into the aspirin therapy group (Group A)，30 mice in

4、to the normal sodium (NS) control group (Group B) and 5 mice into the sham operation group (Group C).Applied the locomotors function scale and the TUNEL immunohistochemistry technique labeled of the spinal cord injuring profiles on 1st、3rd、7th、14th、28th days of post operation respectively.Result Gro

5、up A reduced the neuron apoptosis，the Apoptosis Index (AI) and the results of locomotors function scale compare with Group B，those that has significant difference (P0.05).There is a high relativity between the neuron apoptosis and locomotors function.Conclusion These results suggest that the protect

6、ive effects of aspirin against neuron apoptosis following chronic spinal cord compressive injury. Key words：aspirin；chronic compression；spinal cord injury；neural protection；apoptosis 慢性脊髓壓迫性疾病由于椎管內(nèi)存在占位性病變，脊髓受到持續(xù)、漸進(jìn)性的壓迫，神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損害程度逐漸加重。研究表明，其主要病理機(jī)制在于脊髓受損神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引起一系列繼發(fā)性病理?yè)p傷和臨床癥狀。本實(shí)驗(yàn)研究采用后路漸進(jìn)慢性壓迫性脊髓損傷的動(dòng)

7、物模型，給予阿司匹林干預(yù)，于慢性壓迫性脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)采用原位末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP標(biāo)記法(terminal deoxynucheotide transferasemediated deoxyuridinebiotin nick end labeling，TUNEL)，觀察阿司匹林對(duì)慢性壓迫性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。 1 材料和方法 1.1 慢性壓迫性脊髓損傷動(dòng)物模型的制作 65只體重220250 g的健康Wistar大鼠(雌雄不限，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，2的戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。常規(guī)消毒鋪巾，取后正中切口，切除T10棘突，以平頭鉆

8、行椎板鉆孔，暴露硬膜。用直徑3 mm、螺距0.5 mm、經(jīng)高壓蒸汽滅菌的不銹鋼平頭螺釘旋入T10椎板，螺釘頭端呈水平面。初次旋入時(shí)螺釘頭面僅與硬脊膜接觸，以旋入過(guò)程中大鼠后肢不出現(xiàn)跳動(dòng)，擠捏大鼠尾根部可引出反應(yīng)，且植入螺釘牢固為度，證明未造成脊髓損傷。以后每隔5 d顯露螺釘，將螺釘旋入1/2圈約0.25 mm，造成大鼠脊髓漸進(jìn)性壓迫性損傷，于造模后第1、3、7、14、28 d取材觀察。 1.2 試劑配置 阿司匹林0.18 g加入50 mL雙次蒸餾水，配成濃度為20 mmol/L的懸浮液，現(xiàn)用現(xiàn)配。 1.3 動(dòng)物分組 將上述65只大鼠隨機(jī)分組：慢性脊髓壓迫阿司匹林治療組(A組，30只)，慢性脊髓

9、壓迫生理鹽水對(duì)照組(B組，30只)，假手術(shù)組(C組，5只，僅行椎板鉆孔術(shù))。模型制作完成10 min后，A組腹腔注射阿司匹林(30 mg/kg)，此后每隔5 d同途徑同劑量再次注射；B組腹腔注射等量的生理鹽水。A、B組分別于壓迫過(guò)程中第1、3、7、14、28天取材，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只動(dòng)物。 1.4 行為學(xué)檢查 慢性壓迫性脊髓損傷后1、3、7、14、28 d對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)檢查，采用改良的Tarlov評(píng)分1和斜板試驗(yàn)2。 1.5 病理標(biāo)本制備 分別于不同時(shí)間點(diǎn)取材3，采用TUNEL觀察各組細(xì)胞凋亡率。TUNEL檢測(cè)凋亡試劑盒為武漢博士德產(chǎn)品，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)步驟操作。 1.6 圖像分析 各組各

10、時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)計(jì)數(shù)6張切片(損傷段、損傷上段、損傷下段各2張)，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)處理，分別測(cè)出每張切片凋亡細(xì)胞指數(shù)(AI)及每 mm2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果判定以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。采用高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)，進(jìn)行圖像半定量分析。應(yīng)用凋亡細(xì)胞核數(shù)估計(jì)凋亡細(xì)胞，根據(jù)下列公式計(jì)算：AI凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)。 1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)行多樣本均數(shù)單因素方差分析或兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，以s表示，以0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)。使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 2 結(jié) 果 2.1 行為學(xué)檢查 采用改良的Tarlov評(píng)分和斜板試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，慢性壓迫性脊髓

11、損傷后60只大鼠均出現(xiàn)不同程度后肢癱瘓，排尿障礙。A組運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)良好，尿潴留有所緩解，與B組比較差異有顯著性差異(P0.05)(見(jiàn)表1)。表1 大鼠慢性壓迫性脊髓損傷Tarlov評(píng)分和斜板試驗(yàn)結(jié)果 2.2 各組細(xì)胞凋亡指數(shù)及凋亡率 通過(guò)對(duì)組織染色切片的圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，A組的細(xì)胞凋亡指數(shù)和凋亡率均小于B組(P0.05)(見(jiàn)表23)。 表2 大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果 2.3 病理學(xué)檢查 光鏡下觀察B組切片，可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞水腫，喪失典型的多極形態(tài)。胞核偏位，尼氏小體喪失，噬神經(jīng)元現(xiàn)象明顯。軸突纖維排列結(jié)構(gòu)紊亂，髓鞘脫失，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞增生，有衛(wèi)星現(xiàn)象。部分神經(jīng)

12、元細(xì)胞縮小呈三角形，胞核濃縮深染，呈缺血性改變，亦可見(jiàn)明顯灶性表3 大鼠慢性壓迫性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率結(jié)果 出血壞死區(qū)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。A組切片可見(jiàn)脊髓灰質(zhì)輕度水腫，神經(jīng)元腫脹減輕，有少量膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，白質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，可見(jiàn)病理改變較B組有所減輕(見(jiàn)圖14)。 3 討 論 本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠慢性脊髓壓迫損傷模型中，阿司匹林組的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于空白對(duì)照組(P0.05)，提示阿司匹林對(duì)大鼠慢性脊髓壓迫損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。圖1 慢性壓迫性脊髓損傷后7 d阿司匹林治療組脊髓組 近來(lái)研究認(rèn)為，阿司匹林可通過(guò)對(duì)環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenases，COX2)的作用、抑制

13、核因子B(NFB)激活、對(duì)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的作用、調(diào)控NOS表達(dá)等途徑抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。已知COX主要有COX1、COX2兩種表型，在脊髓神經(jīng)元中COX2的表達(dá)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)4，且COX2表達(dá)峰值與谷氨酸濃度呈正相關(guān)圖4 慢性壓迫性脊髓損傷后28 d阿司匹林治療組脊髓組性5。COX2的過(guò)度表達(dá)亦可使大鼠中樞神經(jīng)的興奮性氨基酸神經(jīng)興奮毒性增強(qiáng)6。提示COX2表達(dá)與脊髓壓迫的損傷因素密切相關(guān)，是興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性以及一氧化氮和NMDA介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。阿司匹林通過(guò)對(duì)脊髓中豐富表達(dá)的COX2的抑制，可完全抑制谷氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的

14、毒性損傷，減輕NMDA介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。同時(shí)抑制脊髓前列腺素合成，減少細(xì)胞黏附和細(xì)胞膜的粘性，減輕脊髓炎性反應(yīng)。NFB能與免疫球蛋白輕鏈基因的增強(qiáng)B序列特異結(jié)合，廣泛存在于各種細(xì)胞中，在細(xì)胞受到損傷因素刺激后可被活化，增強(qiáng)多種炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。阿司匹林可特異性抑制ATP與IK的結(jié)合，阻滯胞漿核因子B復(fù)合物中IB的磷酸化，阻止蛋白酶對(duì)IB的降解，使NFB的信號(hào)通路受阻，對(duì)抗谷氨酸神經(jīng)興奮毒性來(lái)保護(hù)神經(jīng)元7，8，并減輕脊髓受損段的炎性反應(yīng)。此外阿司匹林還可保護(hù)在磷脂酰肌醇代謝中起重要作用的PKC免于NMDA誘導(dǎo)活化，并抑止PKC的蛋白激酶活性，防止其發(fā)生轉(zhuǎn)位并啟動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑，引發(fā)神經(jīng)退行性變9，

15、10。另外，脊髓損傷時(shí)產(chǎn)生過(guò)量的NO，通過(guò)超氧自由基的細(xì)胞毒性作用，造成細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)膜損傷，并激活COX211。同時(shí)，受TNF介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量谷氨酸，使NMDA受體依賴(lài)性的鈣通道開(kāi)放，引發(fā)Ca2內(nèi)流，激活NOS生成NO，繼而激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，升高cGMP水平，促使細(xì)胞凋亡12，13。阿司匹林可通過(guò)抑制中樞和外周神經(jīng)細(xì)胞的iNOS，減少NO生成，并直接清除NO14，15，抑制關(guān)聯(lián)損傷因子的釋放發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡作用。此外，阿司匹林還可延緩神經(jīng)細(xì)胞低氧狀態(tài)下胞外ATP的減少，恢復(fù)ATP水平，抑制谷氨酸釋放16。 有研究報(bào)道17，對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈梗死模型一次性給予阿司匹林，8

16、d后處死，與空白組對(duì)照有明顯神經(jīng)保護(hù)作用。在MPTP誘導(dǎo)的Parkinsons疾病模型中18，以50 mg/kg阿司匹林預(yù)處理的大鼠7 d后取材觀察，發(fā)現(xiàn)阿司匹林可明顯減緩多巴胺的減少。提示一次性給予大劑量阿司匹林其最大神經(jīng)保護(hù)效能在體內(nèi)可至少持續(xù)7 d以上。在大鼠慢性脊髓壓迫模型中給予大劑量甲基強(qiáng)的松龍，第14、28天與空白組對(duì)照神經(jīng)元凋亡情況均有顯著性差異3。以上研究提示在大鼠脊髓壓迫損傷中抑制神經(jīng)元凋亡的干預(yù)具有非劑量相關(guān)的長(zhǎng)時(shí)效性。本實(shí)驗(yàn)采用術(shù)后間斷性大劑量給藥方式，不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡結(jié)果對(duì)比具有顯著性差異，可能是慢性脊髓壓迫性損傷后，神經(jīng)元的抗凋亡途徑以及內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制存在相關(guān)治療

17、干預(yù)的長(zhǎng)效應(yīng)靶點(diǎn)，使阿司匹林不需完全依賴(lài)體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡作用。但具體的效應(yīng)機(jī)制仍需我們進(jìn)一步探索。 綜上所述，在慢性脊髓壓迫損傷后給予阿司匹林，可以減少神經(jīng)元凋亡，緩解相應(yīng)癥狀，對(duì)此類(lèi)疾病治療有積極作用。其抑制神經(jīng)元凋亡的機(jī)制和分子水平途徑有待我們進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Cheng H，Cao Y，Olson L.Spinal cord repair in adult paraplegic rats：partial restoration of hind limb fuctionJ.Science，1996，273(5274)：510513.2Fehlings MG，

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