細(xì)胞衰老與凋亡課件

1、細(xì)胞衰老與凋亡第十五章細(xì)胞衰老(shuilo)與凋亡CELL SENESCENCE AND DEATH第一頁，共四十七頁。http:/ 細(xì)胞衰老與凋亡第一節(jié)細(xì)胞(xbo)衰老Aging ，Senescence，指細(xì)胞隨著年齡增加，機能和結(jié)構(gòu)退行性變化，趨向(qxing)死亡的不可逆現(xiàn)象。衰老是生命的普遍現(xiàn)象，發(fā)生在生態(tài)系統(tǒng)、群落、種群、個體、細(xì)胞以及分子等不同層次。第二頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡一、人體細(xì)胞的動態(tài)(dngti)分類 更新組織：如上皮細(xì)胞、血細(xì)胞。構(gòu)成更新組織的細(xì)胞可分為(fn wi)類： 干細(xì)胞、 過渡細(xì)胞、 成熟細(xì)胞。 穩(wěn)定組織：可補償性增生，如：肝、腎細(xì)胞。 恒久組織：

2、細(xì)胞不再分裂，如神經(jīng)細(xì)胞。 可耗盡組織：如人類的卵巢實質(zhì)細(xì)胞。第三頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡二、細(xì)胞衰老的特征（一）形態(tài)(xngti)變化第四頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡（二）分子(fnz)水平的變化 1. DNA：復(fù)制與轉(zhuǎn)錄受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。 2. RNA：含量減少。 3. 蛋白質(zhì)：含成下降，發(fā)生(fshng)修飾、交聯(lián)。 4. 酶分子：物理與化學(xué)特征改變，酶失活。 5. 脂類：不飽和脂肪酸被氧化。第五頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡三、細(xì)胞(xbo)衰老的分子機理 1. 代謝廢物(fiw)積累：如：脂褐質(zhì)，老年性癡呆（AD）

3、腦細(xì)胞內(nèi)的-淀粉樣蛋白。 2.線粒體DNA突變：線粒體自由基濃度高，mtDNA是裸露分子，容易發(fā)生突變。 腦、心、骨骼肌的氧負(fù)荷最大，組織最易衰老。 caloric restriction能延長大鼠壽命50%-70%。第六頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 Thin rat bury fat rat The rats are both 1000 days old, very old for rats. The one on the right was calorie restricted. The one on the left is near death and shows typical si

4、gns of old age similar to what happens in humans. Image cited from Clive McCay 1939.第七頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡3自由基學(xué)說(xu shu)（free radical theories） 自由基是含不成對電子的原子或基團(j tun)，具有高度反應(yīng)活性。包括：氧自由基（如OH）、氫自由基（H）、碳自由基、脂自由基等。 自由基來源：外源性（如輻射）、內(nèi)源性。 內(nèi)源性自由基產(chǎn)生于由線粒體呼吸鏈電子泄漏產(chǎn)生；由氧化酶（如MFO）催化底物羥化產(chǎn)生。第八頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 自由基可引起(ynq)DNA、

5、蛋白質(zhì)、脂類氧化、變性和交聯(lián)，實驗表明DNA中OH8dG隨著年齡而增加。 正常細(xì)胞內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)。 酶系統(tǒng)：SOD、CAT、GSH-PX。 非酶系統(tǒng)：維生素E、醌類電子受體 Orr和Sohal（1994），將SOD基因?qū)牍?，其壽命比野生型延長1/3。第九頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡4程序性衰老(shuilo)（programmed senescence） 生物的生長、發(fā)育、衰老和死亡都由基因程序控制的，衰老是某些基因依次開啟或關(guān)閉的結(jié)果。 例1. 在小鼠肝中，胚胎早期表達的胞質(zhì)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（cAAT）為A型，隨后停止表達，衰老時則表達B型cAAT 例2. 肝臟中的衰老標(biāo)志(b

6、iozh)蛋白2在老年期表達。第十頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡5復(fù)制(fzh)性衰老（replicative senescence） 細(xì)胞的增殖次數(shù)是有限的，稱“Hayflick”極限。如人胚成纖維細(xì)胞可培養(yǎng)60-70代。 DNA每復(fù)制一次端粒就縮短一段，到一定程度時，則激活(j hu)DNA損傷檢驗，細(xì)胞凋亡。人的成纖維細(xì)胞端粒每年縮短14-18bp。 端粒酶可修復(fù)端粒，此酶僅在干細(xì)胞中表達。第十一頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡6. 衰老(shuilo)基因?qū)W說 子女的壽命與雙親的壽命有關(guān)；動物都有相當(dāng)恒定的平均和最高壽命； 成人早衰癥：約39歲衰老，47歲生命結(jié)束；嬰幼兒早衰癥：1歲衰老

7、，1218歲生命結(jié)束； 早衰癥患者體內(nèi)解旋酶發(fā)生(fshng)突變 。 衰老時，衰老相關(guān)基因（SAG）活躍表達，如senescent cell derived inhibition of DNA synthesis 。第十二頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 Werners syndromeA 37 years old patient， Adoue DFP 1997第十三頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 Hutchinson-Gilford syndrome第十四頁，共四十七頁。http:/ 細(xì)胞衰老與凋亡第二節(jié) 細(xì)胞(xbo)壞死與凋亡細(xì)胞死亡(swng)并非與機體死亡(swng)同步。正常的組織

8、中也發(fā)生細(xì)胞死亡(swng)，它是維持組織機能和形態(tài)所必需的。 第十五頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡一、細(xì)胞(xbo)死亡的方式 （一）細(xì)胞壞死 細(xì)胞受到環(huán)境因素傷害(shnghi)，引起細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。 形態(tài)變化的原因：酶性消化、蛋白變性。 如消化酶來源于死亡細(xì)胞本身的溶酶體，則稱為自溶（autolysis）；若來源于浸潤壞死組織內(nèi)白細(xì)胞溶酶體，則為異溶（heterolysis）。第十六頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 細(xì)胞壞死初期，胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，結(jié)構(gòu)脂滴游離、空泡化，蛋白質(zhì)顆粒增多，核發(fā)生固縮或斷裂。 隨壞死進程，細(xì)胞質(zhì)呈強嗜酸性，蘇木精/伊紅染色呈均一紅色。 細(xì)胞膜不完整

9、，臺盼藍染色陽性(活細(xì)胞不著色)。 DNA隨機降解，細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起(ynq)炎癥。第十七頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡（二）細(xì)胞(xbo)凋亡 細(xì)胞通過(tnggu)出芽的方式形成許多凋亡小體； 凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器； 不引起炎癥； 線粒體無明顯形態(tài)變化，溶酶體活性不增加； 內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖呈梯狀； 凋亡通常是生理性變化，壞死是病理性變化。 第十八頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡www.roche-applied- wn)第二十頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡胸腺細(xì)胞(xbo)正常正常(zhngchng)凋亡(dio wn)第二十一頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡

10、第二十二頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡（三）細(xì)胞(xbo)程序性死亡 細(xì)胞程序性死亡（PCD）是一種基因(jyn)指導(dǎo)的細(xì)胞自我消亡方式。 PCD和細(xì)胞凋亡的區(qū)別在以下方面： PCD是功能性概念，凋亡是形態(tài)學(xué)概念。 PCD的最終結(jié)果是凋亡，但凋亡并非都是程序化的。 PCD存在于胚胎發(fā)育過程中。第二十三頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 C. elegans是研究PCD的理想(lxing)材料（生命周期短，細(xì)胞數(shù)量少）。 第二十四頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 C. elegans雄蟲有1031個體細(xì)胞、約1000個生殖細(xì)胞。 神經(jīng)系統(tǒng)由302個細(xì)胞組成

11、，來自(li z)于407個前體細(xì)胞，105個細(xì)胞發(fā)生了PCD。 控制線蟲PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9。 Ced-3和 Ced-4誘發(fā)凋亡； Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。第二十五頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡2002年10月7日英國人Sydney 、美國人Horvitz和英國人Sulston ，因在PCD方面的研究(ynji)獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎。H. Robert HorvitzJohn E. Sulston Sydney Brenner第二十六頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡二、細(xì)胞(xbo)凋亡的生理和病理學(xué)意義 （一）生理學(xué)意義 1. 生長發(fā)育

12、：組織與器官的塑造（趾的分化）；動物變態(tài)；皮膚(p f)角質(zhì)形成； 2. 免疫細(xì)胞分化：克隆選擇； 3. 防御：清除衰老細(xì)胞、DNA損傷的細(xì)胞、和被病原體感染的細(xì)胞。第二十七頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡Sculpting the digits in the developing mouse paw by apoptosis（Wood 2000）第二十八頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡（二）病理學(xué)意義(yy) 1. 病原體侵染； 誘導(dǎo)凋亡HIV 抑制凋亡Poxvirus 2. 細(xì)胞凋亡不足 腫瘤，自身免疫疾病； 3. 細(xì)胞凋亡過度 神經(jīng)退行性疾?。ˋD，帕金森癥）、心肌梗塞、 再生(zishng

13、)障礙性貧血、骨組織壞死。第二十九頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡三、細(xì)胞(xbo)凋亡的檢測方法 1. 形態(tài)學(xué)，電鏡，光鏡； 2. DNA凝膠電泳ladder； 3. 流式細(xì)胞計； 4. 核酸內(nèi)切酶活力(hul)檢測； 5. 免疫學(xué)方法； 6. Annexin V檢測細(xì)胞膜外表面PS； 7. TUNEL技術(shù)。第三十頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 8. 常用檢測細(xì)胞凋亡的染料： 二乙酸熒光素（FDA），綠色熒光，活細(xì)胞染色(rns)。 Hoechst 33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的細(xì)胞熒光較強。 溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放線菌素D（7-AAD

14、），不通透，正常和凋亡細(xì)胞拒染。 可用不同性質(zhì)的染料對凋亡細(xì)胞進行雙染色。第三十一頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 Human embryo at day 4 morula containing 23 nuclei labelled with DAPI (blue), including seven TUNEL-labelled condensed nuclei (pink, arrow) that were excluded from development (Kate Hardy 1999).第三十二頁，共四十七頁。http:/ 細(xì)胞衰老與凋亡第三節(jié) 細(xì)胞凋亡(dio wn)的分子機理第三十

15、三頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡一、凋亡(dio wn)相關(guān)的基因和蛋白 與細(xì)胞增殖(zngzh)有關(guān)的原癌基因和抑癌基都參于對細(xì)胞凋亡的凋控。 研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等 。第三十四頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡1Caspase家族(jiz) 相當(dāng)于線蟲的ced-3，是引起凋亡的關(guān)鍵酶。特點： 酶活性依賴于cys殘基的親核性； 總是在asp之后(zhhu)切斷底物，故名caspase（cysteine aspartate-specific protease）。 亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個活性亞基，組成的異四聚體

16、。第三十五頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 Caspase classification（Zimmermann 2001）Executioner or effectorAutocatalytic initiator第三十六頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡2Apaf-1 凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1），線蟲的同源物為ced-4。 作用：參與線粒體凋亡途徑，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞過多，腦畸形發(fā)育(fy)。 Apaf-1與cyt c、ATP/dATP結(jié)合后，召集caspase-9，形成凋亡體（apoptosome），激活caspas

17、e-3，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。第三十七頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡3. bcl-2基因(jyn)家族 含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4）。分兩類：抗凋亡基因，如：Bcl-2；促凋亡基因，如：Bax。 促凋亡蛋白能引起線粒體外膜通透性改變，導(dǎo)致(dozh)cyt c釋放，引起凋亡。 bcl-2相當(dāng)于線蟲的ced9。主要定位于線粒體膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。第三十八頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 Bcl-2 gene family（Zimmermann 2001）第三十九頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡4. Fas fas又稱作APO-1，屬TNF受體家族。

18、 1993年人白細(xì)胞分型國際(guj)會議統(tǒng)一命名為CD95。 fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白。 Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合激活caspase。第四十頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 5P53 基因組的守護者。輻射誘導(dǎo)的DNA損傷可通過ATM激活p53，阻斷細(xì)胞周期，并提高Fas的表達，誘導(dǎo)凋亡。 6Myc 轉(zhuǎn)錄因子，生長因子存在(cnzi)，Bcl-2基因表達時，促進細(xì)胞增殖，反之引起細(xì)胞凋亡。 7. ATM 是DNA損傷檢驗的重要蛋白激酶，能激活P53。第四十一頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡（二）Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞(xbo)凋亡 Fas與配體結(jié)合發(fā)生(fshng)三聚化，通過胞內(nèi)的DD區(qū)（Death domain）與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合。 FADD N端通過DED區(qū)（death effector domain）與Caspase-8前體結(jié)合，Caspase-8通過子剪接激活 。第四十二頁，共四十七頁。細(xì)胞衰老與凋亡 Caspase-8引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3、6、7。 Caspase可降解結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、周期(zhuq)蛋白等等。 Caspase還可降解CAD（ caspase-ac