09青翹石油醚部位抑菌成分的篩選(齊萌萌

1、青翹石油醍部位抑菌成分的篩選學(xué)生：齊萌萌指導(dǎo)老師：薛慧活摘要：目的篩選青翹石油酰部位抑菌成分，為進(jìn)一步從連翹中尋找高效低毒的抗菌新藥和抗菌先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。方法采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定青翹石油酰部位中不同化學(xué)部位對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的敏感性。結(jié)果青翹石油酰部位中不同化學(xué)部位對(duì)不同菌株表現(xiàn)了不同程度的抗菌作用。青翹石油酰部位中不同化學(xué)部位對(duì)不同菌株的抗菌作用：大腸桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌。對(duì)于這三種細(xì)菌，抗菌活性部位都集中于FrA6-FrA10。結(jié)論青翹石油酰部位中極性較大的成分具有較強(qiáng)的抗菌活性，是其發(fā)揮清熱解毒功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：青翹；抗菌作用；活性部位Scree

2、ningofAntibacterialComponentsfromPetroleumEtherExtractofUnripenFructusForsythiaeStudent:QiMeng-MengSupervisor:XueHui-qingAbstract:ObjectivescreeningantibacterialcomponentsfromthepetroleumetherextractofUnripenFructusForsythiae,inordertolayfoundationforfurtherresearchonnewdrugsofhigh-performanceandlow

3、toxicity.MethodsKirby-BauerdiscagardiffusionmethodwasusedtodeterminethesensitivityofdifferentfractionsfromUnripenFructusForsythiaesPetroleumetherextractagainstStaphyloccocusaureus,E.coliandCandidaalbicans.ResultsDifferentfractionsobtainedfromthePetroleumetherextractofUnripenFructusForsythiaehavediff

4、erentantibacterialactivitiesagainstdifferentbacteriaasfollowing:E.coliStaphylococcusaureusCandidaalbicans.Forthisthreebacteria,theantibacterialactivefractionsareconcentratedinFrA6-FrA10phases.ConclusionForthePetroleumetherextractofUnripenFructusForsythiae,largerpolarcomponentshavestrongerantibacteri

5、alactivities.Theyarematerialbasesofthetraditionalfunctionclearingawayheatandtoxicmaterial.Keywords:UnripenFructusForsythiae;antibacterialactivity;activefraction連翹為木犀科植物連翹Foesythiasuspensa（Thumb.）Vahl的十燥果實(shí)。秋季果實(shí)初熟尚帶綠色時(shí)采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬十，習(xí)稱“宵翹”；果實(shí)熟透時(shí)采收，曬十，除去雜質(zhì)，習(xí)稱“老翹”1。連翹是常用的活熱解蠹類中藥，臨床應(yīng)用廣泛，目前以連翹為原料的中成藥制劑也很多，

6、如銀翹解蠹片、雙黃連注射液等?，F(xiàn)代藥理研究表明，連翹為廣譜抗菌藥，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性菌均有抑制作用。據(jù)報(bào)道宵翹中的主要有效成分連翹酯苜和連翹苜的含量以及抗菌活性均高于老翹2-4。但目前臨床多習(xí)慣用老翹，對(duì)連翹的研究也多集中于對(duì)老翹的研究5-7,對(duì)宵翹的研究較少，尤其是對(duì)宵翹抗菌活性部位的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)宵翹體外抗菌活性部位的篩選,為背翹抗菌活性成分的進(jìn)一步篩選提供試驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1材料與儀器宵翹石油酰部位：08年5月菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureu$、大腸桿菌（Escherchiacoli）、白色念珠菌（Candidaalbicans

7、）,均由山西省藥品檢驗(yàn)所提供。試劑：95忍醇，石油酰，三氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇等，均為分析純；0.9%氯化鈉注射液（自制）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：050106）;牛肉膏（北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠，批號(hào)：040820）;蛋白月東（北京奧特博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20070816）;慶大霉素細(xì)菌藥敏試紙（杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)：070517）。儀器：LR4001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；CA-111型冷卻水循環(huán)系統(tǒng)（上海愛(ài)郎儀器有限公司）；SHB-88型水循環(huán)真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海

8、一恒科學(xué)儀器有限公司）；DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；BBS-DSC型潔凈工作臺(tái)（上海巴艾貝斯科技有限公司）；BS224S-L型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。1.2分析方法1.2.1宵翹石油酰部位不同極性部位的提取分離拌樣取宵翹石油酰部位浸膏230g,用混合溶劑（氯仿、乙酸乙酯、石油酰）溶解，拌入228g硅膠粉末（200-300目），攪拌均勻，自然揮十。過(guò)濾將拌硅膠樣過(guò)兩層紗布得到淺綠色松散均勻粉末狀物。準(zhǔn)備裝柱取柱層析硅膠（200-300目）1200g用石油酰混懸攪拌，排除氣泡后裝柱（1300*70mm）反復(fù)用石油酰過(guò)柱并拍打柱壁至均勻（柱高93

9、0mm）。濕法裝柱取拌硅膠樣198g（含有樣品99g）加入硅膠柱中，純石油酰洗脫，保留體積3000毫升。收集濃縮洗脫液收集洗脫液6瓶（3000ml一流份），第7瓶開(kāi)始濃縮且編號(hào)。在色帶下移較緩慢時(shí)可換溶劑的極性（從小到大）繼續(xù)洗脫，最后用甲醇沖柱。TLC檢識(shí)（紫外燈254nm下或5%硫酸乙醇溶液顯色）且合并相同流分，減壓濃縮得10個(gè)部分FrA1-FrA10.在分離FrA1時(shí)第一瓶洗脫液中出現(xiàn)了透明的晶體，編號(hào)為“一”，用乙醇洗滌后呈白色，裝于瓶子中保存01.2.2藥敏紙片的制備8將普通定性濾紙用打孔機(jī)打成若十圓形紙片，直徑為6mm,置于十燥潔凈的試管內(nèi)，放入壓力蒸汽滅菌器中經(jīng)121C、20mi

10、n高壓滅菌，十燥。分別取十燥后的十個(gè)部位以及正丁醇部位浸膏0.5mg、1.0mg、2.0mg,用合適的溶劑溶解，將濾紙片放入溶液中，反復(fù)吸取、晾十，直至將溶液吸十，備用。1.2.3培養(yǎng)基的制備固體培養(yǎng)基：用天平準(zhǔn)確稱取36g營(yíng)養(yǎng)瓊脂，加入蒸僻水1000ml,加熱并不斷攪拌，使瓊脂完全溶解。然后放入壓力蒸汽滅菌器中經(jīng)121C、20min高壓滅菌，取出趁熱倒入經(jīng)過(guò)高壓滅菌的培養(yǎng)皿中，厚度約35mm,冷卻凝固后備用。液體培養(yǎng)基9:用天平準(zhǔn)確稱取牛肉膏0.3g,蛋白月東1g,氯化鈉0.5g,加入蒸僻水100ml，加熱并不斷攪拌，用1%NaOH溶液調(diào)節(jié)PH7.27.4。然后放入壓力蒸汽滅菌器中經(jīng)121C

11、、20min高壓滅菌，分裝丁試管中，備用。1.2.4菌懸液的制備用接種環(huán)分別取各菌種一環(huán)，接種丁液體培養(yǎng)基中，放入37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,用滅菌生理鹽水分別稀釋至1X10-3濃度，備用。1.2.5藥物抑菌作用測(cè)定采用K-B紙片擴(kuò)散法10，用無(wú)菌移液管吸取稀釋好的菌懸液0.1mL,置丁培養(yǎng)基中央，用涂布棒涂布均勻。用無(wú)菌鑲子夾取含藥濾紙片貼在培養(yǎng)基表面，以含藥量為10兩勺慶大霉素細(xì)菌藥敏試紙為陽(yáng)性對(duì)照。放入37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察抑菌圈，并用十字交義法測(cè)量抑菌圈直徑。每種濃度對(duì)3種菌均做3組平行對(duì)照，結(jié)果取平均值。2結(jié)果與分析2.1宵翹石油酰部位中不同化學(xué)部位對(duì)大腸桿菌的抗菌作用由表1

12、和圖1可知，除FrA3、FrA4部位外，其余各部位對(duì)大腸桿菌均有一定抑制作用。其活性比較，F(xiàn)rA10FrA7FrA8FrA9FrA6FrA5FrA2FrA1。并且FrA6、FrA7、FrA8、FrA9在樣品量為1.0mg時(shí)抗菌活性最強(qiáng)，而FrA10、FrA6在樣品量為2.0mg時(shí)抗菌活性最強(qiáng)。這與文獻(xiàn)報(bào)道的連翹乙醇提取物的濃度與抑菌作用強(qiáng)弱之間并不成簡(jiǎn)單的正比關(guān)系11相一致，提示我們多種成分同時(shí)存在時(shí)可能僅存在“最適抑菌濃度”。表1青翹石油醍部位中不同化學(xué)部位對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑（單位:mm）樣品量FrA1FrA2FrA3FrA4FrA5慶大霉素0.5mg-101.0mg-8.3-332.0

13、mg6.78.5-10.5樣品量FrA6FrA7FrA8FrA9FrA10慶大霉素0.5mg-88881.0mg1413.813.51210332.0mg14.51381116注:表示沒(méi)有明顯抑菌圈。圖1青翹石油醍部位中不同化學(xué)部位對(duì)大腸桿菌的抗菌作用(a.慶大霉素；1.FrA1;2.FrA2;3.FrA3;4.FrA45.FrA5;6.FrA6;7.FrA7;8.FrA8;9.FrA9;10.FrA10)2.2宵翹石油酰部位中不同化學(xué)部位的最強(qiáng)抑菌作用部位FrA10和正丁醇部位對(duì)大腸桿菌的抗菌作用比較由表2和圖2可見(jiàn)，宵翹石油酰部位中FrA10的抑菌活性大丁正丁醇部位的抑菌活性，說(shuō)明FrA1

14、0的活熱解蠹作用強(qiáng)丁正丁醇部位。表2青翹石油醍部位中最強(qiáng)抑菌化學(xué)部位與正丁醇比較對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑(單位:mm)樣品量FrA10正丁醇慶大霉素0.5mg9-1.0mg106.5332.0mg137.3注：“一”表示沒(méi)有明顯抑菌圈。2.3宵翹石油酰部位中不同化學(xué)部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用由表3和圖3可看出，除FrA1、FrA3、FrA4部位外，其余各部位均對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其活性比較：FrA10FrA5FrA6FrA7FrA8FrA9FrA2。隨著紙片樣品量的增加，抗菌作用強(qiáng)弱表現(xiàn)不同。aaa圖2青翹石油醍部位中最強(qiáng)抑菌化學(xué)部位與正丁醇比較對(duì)大腸桿菌的抑菌（a.慶大霉素；b.

15、正丁醇；10.FrA10）表3青翹石油醍部位中不同化學(xué)部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑（單位:mm）樣品量FrA1FrA2FrA3FrA4FrA5慶大霉素0.5mg-1.0mg-12362.0mg-8-10樣品量FrA6FrA7FrA8FrA9FrA10慶大霉素0.5mg888-81.0mg1098815.5362.0mg10108816注：“一”表示沒(méi)有明顯抑菌圈2.4宵翹石油酰部位中不同化學(xué)部位的最強(qiáng)抑菌作用部位FrA10和正丁醇部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用比較(a.慶大霉素；1.FrA1;2.FrA2;3.FrA3;4.FrA45.FrA5;6.FrA6;7.FrA7;8.FrA8;9

16、.FrA9;10.FrA10)由表4和圖4可見(jiàn)，宵翹石油酰部位中FrA10的抑菌活性小丁正丁醇部位的抑菌活性，說(shuō)明FrA10的活熱解蠹作用弱丁正丁醇部位。表4青翹石油醍部位中最強(qiáng)抑菌化學(xué)部位與正丁醇比較對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑（單位:mm）樣品量FrA10正丁醇慶大霉素0.5mg12101.0mg13.515.53613182.0mg注：“表示沒(méi)有明顯抑菌圈。圖4青翹石油醍部位中最強(qiáng)抑菌化學(xué)部位與正丁醇比較對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌（a.慶大霉素；b.正丁醇；10.FrA10）2.5宵翹石油酰部位中不同化學(xué)部位對(duì)白色念珠菌的抗菌作用由表5和圖5可見(jiàn)，F(xiàn)rA1-FrA5各部位對(duì)白色念珠菌沒(méi)有抑制

17、作用。FrA6-FrA10各部位對(duì)白色念珠菌的抑制作用較弱且各濃度抗菌作用相差不大，在紙片樣品量不同時(shí)，均有顯示出略強(qiáng)抗菌活性的現(xiàn)象。與宵翹不同化學(xué)部位對(duì)大腸桿菌的抗菌作用一樣，說(shuō)明了濃度與抑菌作用強(qiáng)弱之間并不成簡(jiǎn)單的正比關(guān)系表5青翹石油醍部位中不同化學(xué)部位對(duì)白色念珠菌的抑菌圈直徑(單位:mm)樣品量FrA1FrA2FrA3FrA4FrA5慶大霉素0.5mg-1.0mg-302.0mg-樣品量FrA6FrA7FrA8FrA9FrA10慶大霉素0.5mg7779101.0mg88.57-9302.0mg8.57.579.59.5圖5青翹石油醍部位中不同化學(xué)部位對(duì)白色念珠菌的抗菌作用a8古量1(a

18、.慶大霉素；1.FrA1;2.FrA2;3.FrA3;4.FrA45.FrA5;6.FrA6;7.FrA7;8.FrA8;9.FrA9;10.FrA10)2.6宵翹石油酰部位中不同化學(xué)部位的最強(qiáng)抑菌作用部位FrA10和正丁醇部位對(duì)白色念珠菌的抗菌作用比較由表6和圖6可見(jiàn)，宵翹石油酰部位中FrA10的抑菌活性與正丁醇部位的抑菌活性相差不多，而且抑菌作用很弱表6青翹石油醍部位中最強(qiáng)抑菌化學(xué)部位與正丁醇比較對(duì)白色念珠菌的抑菌圈直徑（單位:mm）樣品量FrA10正丁醇慶大霉素0.5mg97.51.0mg9.58.3302.0mg8.59注：“表示沒(méi)有明顯抑菌圈。圖6青翹石油醍部位中最強(qiáng)抑菌化學(xué)部位與正

19、丁醇比較對(duì)白色念珠菌的抑菌（a.慶大霉素；b.正丁醇；10.FrA10）3討論本試驗(yàn)表明：宵翹石油酰部位中不同化學(xué)部位對(duì)不同菌株表現(xiàn)了不同程度的抗菌作用。宵翹石油酰部位提取物對(duì)不同菌株的抗菌作用：大腸桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌。大腸桿菌是目前引起腸胃不適、腹瀉的常見(jiàn)菌，這與中醫(yī)藥認(rèn)為連翹具有活熱解蠹功效的臨床應(yīng)用基本吻合,且金黃色葡萄球菌是目前引起上呼吸道感染的常見(jiàn)菌，這與中醫(yī)藥認(rèn)為連翹具有活熱解蠹功效，以及連翹治療呼吸道感染的臨床應(yīng)用基本吻合。對(duì)丁這三種細(xì)菌，抗菌活性部位集中丁FrA6-FrA10部位；且對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌作用強(qiáng)丁白色念珠菌。這說(shuō)明宵翹石油酰部位中極性較大的成

20、分具有較強(qiáng)的抗菌活性，是其發(fā)揮活熱解蠹功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本試驗(yàn)在研究宵翹石油酰部位的提取物對(duì)大腸桿菌的抗菌作用過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)FrA7、FrA8、FrA9部位的提取物濃度與抗菌作用強(qiáng)弱之間不成正比關(guān)系，查閱相關(guān)資料11，推測(cè)其原因可能是宵翹提取物中的某些極性小的成分提供了菌體生長(zhǎng)所需的“營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”，或是這些極性小的成分刺激了菌體的生長(zhǎng)。由于中藥成分的復(fù)雜性和各種成分性質(zhì)的差異性，使藥物作用過(guò)程和機(jī)理更加復(fù)雜，因此，以往參照抗生素求最小抑菌濃度(MIC)的方法很難準(zhǔn)確地反映背翹的抗菌活性，應(yīng)該尋求它的“最適抑菌濃度”。此外，F(xiàn)rA10的抗菌活性不及正丁醇部位的抗菌活性，可能是由于正丁醇中抗菌活性成分的

21、相對(duì)含量大于FrA10,或者是由于正丁醇中的多種成分發(fā)揮了多重作用，使得抗菌活性升高，也或者是宵翹中主要抗菌活性部位是正丁醇部位。所以，我們有必要將背翹中的抗菌活性部位或抗菌活性成分分離出來(lái)，使其更好的發(fā)揮抗菌作用。現(xiàn)代研究表明，盡管活熱藥活瀉里熱功效與該類藥抗病原體、抗蠹素、抗炎、解熱、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤等藥理作用有關(guān)。但是，在沒(méi)有抗菌藥物的古代，臨床上一些感染性疾病的最終治愈還是依賴活熱藥的抗病原體作用，因此抗菌是這類藥物的主要藥理作用12。本試驗(yàn)反映了宵翹石油酰部位的體外抗菌活性，宵翹在機(jī)體內(nèi)的抗菌效果以及有關(guān)的抗菌活性成分和抗菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1. 國(guó)家藥典委員會(huì)