LAMP技術(shù)及應(yīng)用

1、LAMP技術(shù)及應(yīng)用LAMP技術(shù)簡介 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人員發(fā)明的一種新型的體外等溫擴(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)。該技術(shù)可以在等溫條件下（約65）進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過反復(fù)的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，從而實現(xiàn)在恒溫條件下進(jìn)行連續(xù)快速的核酸擴(kuò)增，并且可以通過簡易直觀的目測判讀結(jié)果，相比傳統(tǒng)PCR大大節(jié)省了時間和實驗操作步驟。LAMP法和其他PCR法的比較LAMP法和其他PCR法的比較技術(shù)特點特異性高4條引物靶向目標(biāo)基因6個區(qū)段，特異性高于PCR和qPCR靈敏度高擴(kuò)增模板可低至

2、每測試10拷貝或更少。檢測時間短恒溫擴(kuò)增，省卻溫度循環(huán)，擴(kuò)增時間60min。設(shè)備簡易，可同時檢測多批樣本不需特定或高端檢測儀器，恒溫設(shè)備即可，例如水浴鍋，可以隨時放入后續(xù)批次樣本。LAMP法使用的酶鏈置換型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase擴(kuò)增對象為雙鏈DNA時，其中一條鏈解離的同時進(jìn)行鏈延長。LAMP法使用最適溫度65的聚合酶。LAMP法的引物設(shè)計LAMP法的原理LAMP法的原理LAMP法所需的試劑LAMP法常規(guī)操作步驟LAMP法的檢測方法瓊脂糖凝膠電泳法 由LAMP原理可知，LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物是莖環(huán)DNA組成的混合物，即有若干倍莖長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)。

3、因此，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在2的瓊脂糖凝膠糖上呈現(xiàn)的是典型的梯狀條帶。（圖A）肉眼觀察法 在LAMP反應(yīng)過程中，可以通過產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生來肉眼直接判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行。（圖B）通過熒光染料檢測 有時，通過肉眼觀察白色沉淀來檢測會存在一定的誤差，所以也可通過添加熒光染料，如溴化乙錠(EB)、SYBR GreenI等進(jìn)行染色，來檢測擴(kuò)增是否發(fā)生。（圖C）LAMP法的應(yīng)用領(lǐng)域 食品領(lǐng)域食物中毒致病菌的檢測食品的衛(wèi)生管理食物中毒的防止靈活運用LAMP法能夠簡單、快速地進(jìn)行基因擴(kuò)增的特征，LAMP技術(shù)在各個領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用。 臨床領(lǐng)域病原菌、病毒的檢測 及鑒定 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域植物病害的早期發(fā)

4、現(xiàn) 及蔓延防止轉(zhuǎn)基因作物的檢測 環(huán)境領(lǐng)域環(huán)境、水中病原微生物 的檢測 工業(yè)領(lǐng)域工業(yè)產(chǎn)品用大量 DNA的生產(chǎn)成為可能 畜牧業(yè)領(lǐng)域雌雄性別判斷病原微生物的檢測遺傳病的發(fā)現(xiàn)LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用靶標(biāo)限定: 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群臨床上感染人類的是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌。對檢測對象的準(zhǔn)確限定能避免假陽性過高而增加治療成本，長遠(yuǎn)來說，更有利于避免耐藥性的產(chǎn)生。gyrB基因作為結(jié)核分枝桿菌重要的功能基因，在復(fù)合群進(jìn)化過程中非常保守，LAMP法檢測即以gyrB基因作為靶標(biāo)。LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用適宜的檢測對象以臨床上引起結(jié)核感染

5、的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群為檢測對象，可避免假陽性過高。 反應(yīng)管預(yù)裝反應(yīng)體系擴(kuò)增及檢測在全封閉反應(yīng)管中進(jìn)行，有效降低氣溶膠污染；用戶操作簡便、減少操作誤差。結(jié)果易讀產(chǎn)物和顯色液直接顯色即可肉眼判斷結(jié)果。技術(shù)特點：LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用臨床試驗 LAMP法和對照試劑（BD快速培養(yǎng)）對比結(jié)果靈敏度89.54% 陽性結(jié)果預(yù)期值98.13% 特異性98.93% 陰性結(jié)果預(yù)期值93.77% 總符合率95.31%LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用臨床試驗 LAMP法和對照試劑（TB-qPCR）對比結(jié)果陽性一致率=88.56% 陰性一致率=93.06% 總符合率=91.36%LAMP法在結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用現(xiàn)有結(jié)核診斷方法和環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法比較一點建議實驗室嚴(yán)格PCR分區(qū)