巴斯德畢赤酵母新型分泌表達(dá)載體構(gòu)建

1、 文章編號(hào) :10083464(2003 01003704巴斯德畢赤酵母新型分泌表達(dá)載體構(gòu)建韋宇拓 , 甘鳳瓊 , 蘇華波 , 趙穎怡 , 汪嶸 , 黃日波(廣西大學(xué) 生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心 , 廣西 南寧 530005摘要 :巴斯德畢赤酵母分泌表達(dá)載體 pP I C I NU 是利用來源于克魯維酵母 (K luy vero m y ces m arx ianus 的菊 粉 酶 基 因 信 號(hào) 肽 DNA 序 列 (ISP 構(gòu) 建 的。 表 達(dá) 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 表 明 , 帶 有 分 泌 表 達(dá) 載 體 pP I C I NU 的 -1, 3-1, 4葡 聚 糖 酶 基 因 重 組 菌 , 具 有

2、與 帶 有 表 達(dá) 載 體 pP I C 9K (帶 有 因 子 信 號(hào) 肽 的 -1, 3-1, 4葡聚糖酶基因重組菌相同的分泌效率 。 關(guān)鍵詞 :巴斯德畢赤酵母 ; 克魯維酵母菊粉酶基因信號(hào)肽 ; 分泌表達(dá) ; 因子信號(hào)肽中圖分類號(hào) :Q 782 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :ACon struction of a P ich ia p astorisYu tuo , GAN Feng qi ong , SU H ua bo ,ZHAO Y ing yi , W AN G Rong , HUAN G R i bo(B i o techno logy R esearch Cen ter , Guangx i

3、 U n iversity , N ann ing 530005, Ch ina Abstract :T he secreting exp ressi on vecto r , pP I C I NU con tain ing inu linase signal pep tide (ISP from K luy vero m y ces s m a rx ianu , of P ich ia p astoris w as con structed . T he exp ressi on resu lts show ed that the secreti on efficiency of the

4、 beta1, 31, 4glucanase of recom b inan t P . p astoris con tain ing p P I C I NU w as as h igh as that of recom b inan t P . p astoris harbo ring pP I C I 9K carrying facto r p rep ro p ep tide .Key wards :P ich ia p astori ; signal pep tides of K luy vero m y ces s m a rx ianu inu linase ; secretin

5、g ex 2p ressi on ; -facto r p rep ro pep tide Bong 等研究中發(fā)現(xiàn)在克魯維酵母 (K luy vero m y ces m a rx ianus 中 , 大部分菊粉酶能被分泌到胞外 , 將其先導(dǎo)肽用在釀酒酵母中能促進(jìn)多種外源蛋白分泌到胞外 , 分泌效率高于常用的 因子信號(hào)肽 1。 因 此 , 克魯維酵母菊粉酶信號(hào)肽可能是一種能引導(dǎo)外源蛋白有效分泌的信號(hào)肽 , 但將其信號(hào)肽用于促進(jìn) 外源蛋白在巴斯德畢赤酵母 (P ich ia p astoris 中分泌表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未有相關(guān)報(bào)道 。我們?cè)?因子 信號(hào)肽在巴斯德畢赤酵母中成功使 1, 31, 4葡

6、聚糖酶表達(dá)并分泌到胞外 2, 本研究利用克魯維酵 母菊粉酶基因的信號(hào)肽序列構(gòu)建新型巴斯德畢赤酵母分泌型表達(dá)載體 , 并表達(dá) 1, 31, 4葡聚糖酶 , 由此比較 因子信號(hào)肽和菊粉酶信號(hào)肽在巴斯德畢赤酵母中的分泌效率 , 為巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) 尋找到一種新的能高效分泌外源蛋白的信號(hào)肽 。第 22卷第 1期 V o l 122, N o 11廣 西 農(nóng) 業(yè) 生 物 科 學(xué) Journal of Guangxi A gric . and B i o l . Science 2003年 3月 M ar . , 2003收稿日期 :20020829基金項(xiàng)目 :國(guó)家高技術(shù) 863資助項(xiàng)目 (2001

7、AA 214171作者簡(jiǎn)介 :韋宇拓 (1971 , 男 , 廣西貴港人 , 廣西大學(xué)博士研究生 ; 黃日波為通訊聯(lián)系人 。 1 材料和方法111材料浸麻芽孢桿菌 (B acillus m acerans 1164 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心 。 巴斯德畢赤 酵母表達(dá)系統(tǒng)試劑盒 (M u lti -Cop y P ich ia Exp ressi on K it 購(gòu)自 Invitrogen 公司 。 大腸桿菌菌株 DH 5由本 實(shí) 驗(yàn) 室 保 存 。 寡 聚 核 苷 酸 由 Sangon 生 物 公 司 合 成 。 核 酸 酶 購(gòu) 自 大 連 T akara 。 地 衣 多 糖 (

8、lichenan 購(gòu)自 Sigm a 公司 。 -1, 3-1, 4葡聚糖酶雜合基因 bg l HAM 的擴(kuò)增在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 。 112方法11211 DNA 的操作 、 重組 、 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn) 3。11212分泌表達(dá)載體 pP I C I NU 的構(gòu)建參照文獻(xiàn) 1,設(shè)計(jì)并合成菊粉酶 inu linase 信號(hào)肽 DNA 序 列 (簡(jiǎn)稱 ISP , 在 ISP 序列兩端設(shè)計(jì) B am H I 和 E co R I 兩個(gè)酶切位點(diǎn)利于連接到載體 。將 ISP 片段連 接到巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)無先導(dǎo)肽的表達(dá)載體 pP I C 315K 的多克隆位點(diǎn)上 , 并進(jìn)行測(cè)序分析 , 正確 的重組

9、子即為分泌表達(dá)載體 p P I C I NU 。圖 1 I SP 信號(hào)肽序列的核酸序列F ig 11 Nucleotide sequences of i nuli nase signal peptide (I SP 11213 酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒 pP I C I NU -HAM 和 p P I C 9K -HAM 的構(gòu)建同文獻(xiàn) 2,根據(jù) Gene B ank 中 -葡聚糖酶基因的已知序列設(shè)計(jì)引物 , 以浸麻芽孢桿菌總 DNA 為模板 , PCR 擴(kuò)增 -葡聚糖酶雜 合基因 bg l HAM 。 引物劃線為部分 E co R I 識(shí)別位點(diǎn) 。上游引物 :5 -GGCGGA TCGTTTTTTGA

10、ACCTTTTAA CA GCTTTAA TCCGA GTACA -3下游引物 :5 -GCTGCAA TCA TA TTAA TTG -3PCR 產(chǎn)物經(jīng) E co R I 消化后分別連接到構(gòu)建好的分泌表達(dá)載體 pP I C I NU 和試劑盒本身提供的分 泌 表 達(dá) 載 體 p P I C 9K 先 導(dǎo) 肽 的 下 游 , 重 組 質(zhì) 粒 分 別 轉(zhuǎn) 化 DH 5感 受 態(tài) 細(xì) 胞 , 以 含 氨 芐 青 霉 素 (100g mL 的 LB 平板篩選轉(zhuǎn)化子 , 并經(jīng)酶切鑒定 , 將獲得重組質(zhì)粒 , 分別命名為 pP I C I NU -HAM 和 p P I C 9K -HAM 。11214

11、巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng) 、轉(zhuǎn)化 、高拷貝菌株篩選和鑒定及重組菌的表達(dá)均參照 Invitrogen 公 司產(chǎn)品說明書 :M u lti -Cop y P ich ia Exp ressi on K it In structi on M anual 。11215重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)分別取重組酵母單菌落 P ich ia p astoris pP I C I NU -HAM 、 P ich ia p as 2toris pP I C 9K -HAM , 以空載體 p P I C I NU 和 p P I C 9K 轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌株 K M 71的重組酵母菌 作 對(duì)照。 重組酵母菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)于

12、10mL BM GY 培養(yǎng)基中 1%酵母提取物 , 2%蛋白胨 , 1134%YNB , 0100004%B i o tin , 1%甘油 (體 積 比 , 30 劇 烈 振 搖 使 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 至 飽 和 狀 態(tài) (A 600=1020 , 離心收集菌體 , 加入 10mL 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 BMM Y (用 015%甲醇代替 BM GY 中的甘 油 , 30下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng) 10d , 每 12h 取樣及補(bǔ)加甲醇 , 維持甲醇濃度為 015%。11216重組 -葡聚糖酶酶活性測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn) 4,-葡聚糖酶的活力可通過檢測(cè) lichenan 經(jīng) -葡 聚糖酶作用后產(chǎn)生的還原糖的量來測(cè)定 。 1U

13、定義為每分鐘產(chǎn)生 1m o l 的還原糖 (以葡萄糖為參比 所 需要的酶量 。還原糖量的測(cè)定采用 3, 5一二硝基水楊酸 (DN S 比色法 5(測(cè)三個(gè)重復(fù)樣取平均值 。 分泌 -葡聚糖酶活力的測(cè)定 :取 1mL 發(fā)酵液 8000r m in 離心 5m in 后取上清測(cè)定 -葡聚糖酶的活 83廣 西 農(nóng) 業(yè) 生 物 科 學(xué) 第 22卷 力為分泌到胞外的酶活 。胞內(nèi)酶活的測(cè)定 :菌體按文獻(xiàn) 3加酵母破胞緩沖液至 1mL , 用 lyticase 破 胞后測(cè)定 -葡聚糖酶的活力為胞內(nèi)的酶活 。11217表達(dá)產(chǎn)物的 SD S PA GE 分析重組酵母 30誘導(dǎo)培養(yǎng) , 測(cè)定發(fā)酵液酶 , 酶活力最高

14、時(shí)取 1mL發(fā)酵液離心去除菌體 , 取 3L 上清液進(jìn)行 SD S PA GE 分析 3。2結(jié)果分析211分泌表達(dá)載體將合成 ISP 的兩條寡聚核苷酸退火后 , 用 B am H I 和 E co R I 消化后插入表達(dá)載體 pP I C 315K 的多克 隆位點(diǎn) , 篩選重組子并進(jìn)行測(cè)序分析 , 結(jié)果證明 ISP 片斷已正確插入質(zhì)粒 pP I C 315K 即得到新的分泌表 達(dá)載體 pP I C I NU 。將擴(kuò)增得到的 -葡聚糖酶雜合基因 bg l HAM 用 E co R I 消化后分別連接到用 E co R I 消化的載體 p P I C I NU 和 pP I C 9K , 連接產(chǎn)物

15、轉(zhuǎn)化 DH 5感受態(tài)細(xì)胞 , 提取質(zhì)粒經(jīng)酶切 、電泳鑒定獲得 正向的重組質(zhì)粒篩選正確方向的克隆 , 分別得到重組質(zhì)粒 pP I C I NU -HAM 和 pP I C 9K -HAM 。 212巴斯德畢赤酵母的 -葡聚糖酶表達(dá)菌株將構(gòu)建好的 -葡聚糖酶表達(dá)載體 p P I C I NU -和 p I C 9K YPD 平板篩 選高拷貝的重組菌 , 分別獲得抗 G (2m , 分 別獲得三株 -HAM 1, 2, 3和 K M 71 I NU -HAM 1, 2, 3。 213 -將 篩 選 -葡 聚 糖 酶 高 產(chǎn) 菌 株 以 導(dǎo) 入 空 白 載 體 的 重 組 菌 K M 71 pP I

16、C I NU 和K M 71 pP I C 9K 分別作為對(duì)照 (CK , 誘導(dǎo)培養(yǎng)在發(fā)酵液的 -葡聚糖酶活力最高時(shí) , 同時(shí)取菌體破胞 后測(cè)定胞內(nèi)的 -葡聚糖酶的活力 , 與發(fā)酵液的酶活相比就為先導(dǎo)肽的分泌效率 , 結(jié)果如表 1所示 , 信 號(hào)肽平均分泌百分比 ISP 為 9816%, 因子為 9813%。表 1 重組巴斯德畢赤酵母菌胞外和胞內(nèi) -葡聚糖酶活的比較 Table 1 The bet a -1, 3-1, 4glucanase avtiv ity of reco m bi nan t P ich ia p astoris酵母菌株Yeaststrains 胞外酶活力 A ctivi

17、ty of exoenzym e U mL -1胞內(nèi)酶活力 A ctivity of endoenzym e U mL 分泌百分比 Percentage of secreti on %酵母菌株 Yeast strains 胞外酶活力 A ctivity of exoenzym e U mL -1胞內(nèi)酶活力 A ctivity of endoenzym e U mL 分泌百分比 Percentage of secreti on%K M 71 pP I C I NU HAM 1 326144119818K M 71 pP I C 9K HAM 1 296124159815K M 71 pP I C

18、 I NU -HAM 2 29818413981371 93 243114199810平均 A verage 292184119816平均 A verage 275154189813K M 71 pP I C I NU (CK 00K M 71 pP I C 9K (CK 00結(jié)果表明所構(gòu)建的分泌表達(dá)載體 pP I C I NU 和 pP I C 9K 都能夠很好地分泌表達(dá) -葡聚糖 , 而空白 對(duì)照 -葡聚糖酶活檢測(cè)不到 。胞外和胞內(nèi)酶活的比較表明分泌表達(dá)載體 pP I C I NU 分泌效率不低于以 使用 因子信號(hào)肽的分泌表達(dá)載體 p P I C 9K 。214分泌表達(dá)產(chǎn)物的 S D S

19、-PAGE 分析將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)到胞外酶活最高時(shí) , 取發(fā)酵液進(jìn)行 SD S -PA GE 分析 , 結(jié)果 (圖 2 表明 :因 子信號(hào)肽和 ISP 信號(hào)肽都能使 -葡聚糖酶雜合基因 bg l HAM 在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)并分泌到發(fā)酵 液 , 兩者的分子量相同與由基因序列推測(cè)所得 24KD 理論分子量基本一致 , 這表明 -葡聚糖酶雜合基 因 bg l HAM 不僅得到了表達(dá) 、 分泌 , 而且 (因子信號(hào)肽和 ISP 信號(hào)肽都能夠被正切切割 。93第 1期 韋宇拓等 :巴斯德畢赤酵母新型分泌表達(dá)載體構(gòu)建 3討論圖 2 S D S -PAGE 12 expression by S D S -

20、PAGE 1. 菌株 K M 71 pP I C 9k 的總分泌蛋白 ; 2. 菌株 K M 71 pP I C 9k -HAM 1的總分泌蛋 白 ; 3. 菌株 K M 71 pP I C I 的總分泌蛋白 ; 4. 菌 株 K M 71 pP I C I NU -HAM 1的總分泌蛋白 ; 5. 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) 1. To tal secreted p ro teins of K M 71 pP I C 9k ; 2. To tal secreted p ro teins of K M 71 pP I C 9k -HAM 1; 3. To tal secreted p ro teins of

21、K M 71 pP I C I NU ; 4. To tal secreted p ro teins ofK M 71 pP I C I NU HAM 1; 5. P ro tein m arker .目前 , 有多種先導(dǎo)肽成功地應(yīng)用于巴斯德畢赤酵母的分泌表達(dá) , 最常用的是來源于釀酒酵母的 因子信號(hào)肽和巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶信號(hào)肽 , 其中以 因子信號(hào)肽最為成功 , 也是使用最廣泛的先導(dǎo)肽 , 它能促進(jìn)多種異源蛋白在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達(dá) 6。 然而 , 信號(hào)肽對(duì)不同的異源蛋白分泌效率會(huì)有很大的差異 , 有些外源蛋白甚至不能被 因子和酸性磷酸酶信號(hào)肽分泌 , 需要新的信號(hào)肽才能使外源蛋

22、白分泌 7。 有些信號(hào)肽的分泌效率受胞內(nèi)m RNA 的積累水平 、培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)的影響 8。 因此尋找更 多有效的信號(hào)肽 , 比較不同信號(hào)肽對(duì)異源蛋白的分泌效率具有重要的意義 。本文研究利用菊粉酶的信號(hào)肽序列來構(gòu)建巴斯德畢赤酵母分泌載體并表達(dá)了 -葡聚糖酶 , 結(jié)果表明 ISP 胞 外 , p P I C 9K 的 L ys -A rg , 泌 , 表達(dá)產(chǎn)物的信號(hào)肽能被內(nèi)切蛋白酶 (endop ro tease 正確識(shí)別并切割 9。 此外 , ISP 信號(hào)肽序列僅為 25個(gè)氨基酸遠(yuǎn)小于 因子的 75個(gè)氨基酸 , 這有利于減少表達(dá)載體的分子量 , 提高整合到宿主染色體上外源基因表達(dá)盒的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)

23、錄效率 。但是 I NU 能否促進(jìn)其它蛋白的分泌 , 還需要作進(jìn)一步的研究 。 參考文獻(xiàn) :1 CHUN G B H , NAM S W , K I M B M 1Comm unication to the editor highly efficient secretion of heterologous p roteins from S accharo m y cescerev isiae using inulinase signalpep tides J 1B i o techno logyandbi oengineering , 1996, 49: 47347912蘇華波 , 韋宇拓 ,

24、 黃鯤 , 等 1-葡聚糖酶雜合酶基因 bglHAM 的克隆及在 P 1p astoris 中表達(dá) J 1廣西大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 , 2002, 27:101313 SAM BROO K J , RU SSELL D W . M o lecular C loning -A L abo rato ry M anual (th ird editi on M . C lod Sp ringH arbo r , N ew Yo rk :By C lod Sp ring H arbo L abo rato ry P ress 1200114 AND ER SON M A , STON E B A . A new substrate fo r investigating the specificity of -lucanhydro lates J 1FEBS L etters , 1975, 52:20220715張龍翔 , 張庭芳 , 李令媛 . 生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù) (第 2版 M 1北京 :高等教育出版社 , 199716 CER EGH I NO J L , CR