餐飲具的微生物檢驗(yàn)技術(shù)

1、 飲食業(yè)食飲具消毒是控制腸道傳染病發(fā)生和流行的重要環(huán)節(jié)之一，現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB 14934-94食（飲）具消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 。該標(biāo)準(zhǔn)適用于賓館、飯店、餐廳、食堂等飲食企業(yè)的食（飲）具，也適用于個(gè)體攤點(diǎn)的食（飲）具。一、餐飲具消毒指標(biāo)(感官指標(biāo)、理化指標(biāo)、細(xì)菌指標(biāo))1 感官指標(biāo)1.1物理消毒（包括蒸汽、煮沸等熱消毒）：食（飲）具必須表面光潔、無(wú)油漬、無(wú)水漬、無(wú)異味。1.2化學(xué)消毒：食（飲）具表面必須無(wú)泡沫、無(wú)洗消劑的味道，無(wú)不溶性附著物。2理化指標(biāo) 采用化學(xué)消毒的食（飲）具，必須用潔凈水清洗，消除殘留的藥物。用含氯洗消劑消毒的食（飲）具表面殘留量，應(yīng)符合表1的要求。 表1 理化指標(biāo)項(xiàng) 目指 標(biāo)

2、游離性余氯，mg/L 0.3烷基（苯）磺酸鈉，mg/100cm2 0.13 細(xì)菌指標(biāo) 采用物理或化學(xué)消毒的食（飲）具均必須達(dá)到表2的要求。（發(fā)酵法與紙片法任何一法的檢驗(yàn)結(jié)果均可作為判定依據(jù)。 ） 表2 細(xì)菌指標(biāo)項(xiàng) 目指 標(biāo)大腸菌群發(fā)酵法,個(gè)/100cm2 3紙片法,個(gè)/50cm2不得檢出致病菌不得檢出二采樣與檢驗(yàn)方法1發(fā)酵法檢測(cè)大腸菌群1.1采樣方法食（飲）具抽檢碗、盤、口杯，將2.0cm2.5cm（5cm2）滅菌濾紙片緊貼內(nèi)面各10張（總面積50 cm2、）、碟、匙、酒杯以每5件為1份，每件內(nèi)面緊貼滅菌濾紙片各2張（總面積50 cm2/份）,經(jīng)1min，按序取置入50 mL滅菌鹽水試管中，充

3、分振蕩后，制成原液?？辏喝∶侩p的下段12 cm處約50 cm2（l2cm2cm2cm），置入50 mL 滅菌鹽水試管中，充分振蕩20次，制成原液。1.2操作步驟1.2.1 初發(fā)酵試驗(yàn) 選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL，361 培養(yǎng)24 h2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。 2紙片法檢測(cè)大腸菌群食（飲）具消毒采用專用的大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片。2.1采樣方法隨機(jī)抽取消毒后準(zhǔn)備使用的各類食具

4、（碗、盤、杯等），取樣量可根據(jù)大、中、小不同飲食行業(yè),每次采樣610件,每件貼紙片兩張,每張紙片面積25cm2（5cm5cm）用無(wú)菌生理鹽水濕潤(rùn)大腸菌群檢測(cè)用紙片后，立即貼于食具內(nèi)側(cè)表面，30s后取下，置于無(wú)菌塑料袋內(nèi)。筷子以5只為一件樣品，用毛細(xì)吸管吸取無(wú)菌生理鹽水濕潤(rùn)紙片后，立即將筷子進(jìn)口端（約5cm）抹拭紙片，每件樣品抹拭兩張，放入無(wú)菌塑料袋內(nèi)。2.2檢驗(yàn)方法將已采樣的紙片置37培養(yǎng)1618 h，若紙片保持紫藍(lán)色不變?yōu)榇竽c菌群陰性，紙片變黃并在黃色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)或片狀紅暈為陽(yáng)性。 致病菌檢驗(yàn) GB 4789.4-2010 沙門氏菌檢驗(yàn).mht GB 4789.10-2010金黃色葡萄

5、球菌檢驗(yàn).mht GB/T 4789.5-2003 志賀氏菌檢驗(yàn).mht GB/T 4789.11-2003溶血性鏈球菌檢驗(yàn).mht 3.1 沙門氏菌檢驗(yàn)傷寒沙門氏菌傷寒沙門氏菌 沙沙門門氏氏菌菌典典型型群群落落檢檢 樣樣25g(ml)25g(ml)樣品樣品+225mlBPW+225mlBPW1ml+TTB10ml1ml+SC10ml36361 1 ，8h-18h8h-18hBSXLD(或或HE、顯色培養(yǎng)基、顯色培養(yǎng)基)挑取可疑菌落挑取可疑菌落 42 42 1 1 ，18h24h18h24h 36 36 1 1 ，18h24h18h24h36 36 1 1 ，40h48h40h48h36 36

6、 1 1 ，18h24h18h24h生化鑒定生化鑒定試劑盒試劑盒或全自動(dòng)或全自動(dòng)微生物微生物生化鑒定生化鑒定系統(tǒng)系統(tǒng)+ +A1A1A2A2A3A3反應(yīng)反應(yīng)結(jié)果結(jié)果與左側(cè)與左側(cè)描述描述不符不符 甘露醇甘露醇+ +、山梨醇、山梨醇+ + ONPG-ONPG- 沙門氏菌，血清學(xué)試驗(yàn)沙門氏菌，血清學(xué)試驗(yàn) 非沙門氏菌非沙門氏菌 報(bào)報(bào) 告告TSI，賴氨酸，賴氨酸，NA，靛基質(zhì)，尿素（，靛基質(zhì)，尿素（pH7.2），），KCN表1 沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS 瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變

7、。HE 瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。XLD 瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進(jìn)行判定。表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基初步判斷斜面 底層產(chǎn)氣硫化氫KA（） （）可疑沙門氏菌屬KA（） （）可疑沙門氏菌屬AA（） （）可疑沙門氏菌屬AA/非沙門氏菌KK/非沙門氏菌注：K：產(chǎn)堿，A：產(chǎn)酸；：陽(yáng)性，：陰性；（）：多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性；/：陽(yáng)性或陰

8、性其他生化試驗(yàn):接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí),可直接接種蛋白胨水 （供做靛基質(zhì)試 驗(yàn)）、尿素瓊脂 （pH7.2）、氰化鉀 （KCN） 培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑 取可疑菌落接種。于 36 1 培養(yǎng) 18 h24 h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至 48 h，按表 3 判定結(jié)果。將已挑菌 落的平板儲(chǔ)存于 2 5 或室溫至少保留 24 h，以備必要時(shí)復(fù)查。 表 3 沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號(hào) 硫化氫 （H2S） 靛基質(zhì) pH7.2尿素 氰化鉀 （KCN） 賴氨酸脫羧酶 A1 A2 A3 / 注：陽(yáng)性；陰性；/陽(yáng)性或陰性。 注：陽(yáng)性；陰性；/陽(yáng)性或陰性。結(jié)果判定:反應(yīng)序

9、號(hào)A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有2項(xiàng)異常為非沙門氏菌。表4沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）沙門氏菌或（要求符合本群生化特性）沙門氏菌個(gè)別變體（要求血清學(xué)鑒定結(jié)果）注：表示陽(yáng)性；表示陰性。a）抗原的準(zhǔn)備抗原的準(zhǔn)備 一般采用一般采用 1.21.5瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。原。 O 血清不凝集時(shí)，將菌株接種在瓊脂量較高的（如血清不凝集時(shí)，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2 3） 培養(yǎng)基上再檢查；如果是由

10、于培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了抗原的存在而阻止了O 凝集反凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌苔于應(yīng)時(shí)，可挑取菌苔于 1 mL 生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。火焰上煮沸后再檢查。H 抗原發(fā)育不良時(shí)，將菌株接種在抗原發(fā)育不良時(shí)，將菌株接種在0.550.65半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，在其邊半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.30.4半固體瓊脂的半固體瓊脂的小玻管小玻管1次次2 次次,自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。 (5)(5)血清學(xué)鑒

11、定血清學(xué)鑒定 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)程序見圖1。發(fā)酵乳糖的某種腸桿菌不發(fā)酵乳糖的某種腸道菌，而且產(chǎn)生硫化氫，可能是沙門氏菌 不發(fā)酵乳糖，呈藍(lán)綠色或藍(lán)色,可能就是志賀氏菌沙門氏菌有黑色中心,如果沒有黑色中心，就很可能是志賀氏菌了 。SS平板照片不發(fā)酵乳糖 發(fā)酵乳糖麥康凱平板照片菌落為粉紅色，半透明的，可能為志賀氏菌。菌落為無(wú)色半透明狀，可能為志賀氏菌。2志賀氏菌志賀氏菌3沙門氏菌沙門氏菌4大腸桿菌大腸桿菌志賀氏菌TSI斜面仍為紅色；底層產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，變黃色；不產(chǎn)H2S，不出現(xiàn)黑色。志賀氏菌四個(gè)群的生化特性生化群5%乳糖甘露醇棉子糖甘油靛基質(zhì)A群：痢疾志賀氏菌-（+）-/+B群：福氏志賀氏菌-+-（

12、+）C群：鮑氏志賀氏菌-+-（+）-/+D群：宋內(nèi)氏志賀氏菌+（+）+d-注：+陽(yáng)性；-陰性；-/+多數(shù)陰性，少數(shù)陽(yáng)性 三、細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室配置 1.細(xì)菌檢驗(yàn)操作室（細(xì)菌檢驗(yàn)操作室是細(xì)菌培養(yǎng)與檢驗(yàn)主要操作室，主要設(shè)施是實(shí)驗(yàn)臺(tái)）； 2.培養(yǎng)基制作室（培養(yǎng)基室是制作、配制微生物培養(yǎng)所需培養(yǎng)基及檢驗(yàn)用試劑的場(chǎng)所）； 3.洗涮消毒室（洗涮消毒室用以消毒洗涮待用與已用之玻璃器皿，培養(yǎng)基及污物）。四、微生物實(shí)驗(yàn)室的基本儀器配備 生化培養(yǎng)箱，冰箱、生物顯微鏡、天平、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌器、微波爐(電爐)、PH試紙或PH計(jì)、超凈工作臺(tái)等。五、微生物實(shí)驗(yàn)室的輔助用具與物品 紫外滅菌燈、量筒、滅菌吸管、玻璃試管、培養(yǎng)皿（9cm）、三角瓶、酒精燈、試管架、接種環(huán)（針）、剪刀、鑷子