車前草黃酮類化合物的微波輔助提取工藝研究(1)

1、.閩南師范大學(xué)畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）車前草黃酮類化合物的微波輔助提取工藝研究Study on Microwave-assisted Extraction Technology of flavonoids in Plantago asiatica系 別： 生物科學(xué)與技術(shù)系 專 業(yè)： 食品科學(xué)與工程 ：摘要研究車前草黃酮類化合物的微波輔助提取工藝。本實(shí)驗(yàn)建立在普通乙醇浸提法的基礎(chǔ)上輔以微波輔助提取的方法，對(duì)車前草中黃酮類化合物提取的工藝研究。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)確定乙醇濃度、料液比、微波時(shí)間、微波功率、水浴時(shí)間、水浴溫度等因素對(duì)車前草黃酮類化合物提取工藝的影響，利用正交試驗(yàn)確定最佳工藝條件。結(jié)果表明:車

2、前草黃酮類化合物微波輔助提取法的最佳工藝條件為乙醇濃度70%、料液比140、微波功率700 W、微波時(shí)間80 s、水浴時(shí)間1.5 h、水浴溫度80，在此條件下車前草中黃酮類化合物提取率為27.32%。微波輔助提取法相比普通浸提法用時(shí)短、提取率高。關(guān)鍵詞：車前草；黃酮；微波輔助；提取工藝Abstract This is a study on microwave - assisted extraction technology of plantains flavonoid, which based on common ethanol immersion extraction accompanied

3、 by the microwave. The experiment applied single-factor test to confirm the influential elements of the extraction technology of plantains flavonoid, including ethanol concentration, solid-liquid ratio, microwave irradiation time, microwave power, time and temperature of water bath, and the orthogon

4、al experiment to make sure the optimum technological conditions .The results showed that: the optimum conditions of microwave-assisted extraction plantain flavonoid were 70% ethanol concentration, ratio of solid to liquid 1:40, 700 W microwave power, 80 s microwave time, 1.5 h bath time, and the tem

5、perature is 80 . The extraction rate of flavonoid under such circumstance was 27.32%. So, Microwave-assisted extraction is a time-saving and high-efficient method than ordinary extraction.Key words: Plantago major; flavonoids; microwave-assisted; extraction process目錄摘要I前言11 實(shí)驗(yàn)材料與方法11.1 材料11.1.2 試劑11

6、.1.3 儀器21.2 實(shí)驗(yàn)方法21.2.1 樣品處理21.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制21.2.3微波提取條件的優(yōu)化31.2.4常規(guī)提取法與微波輔助提取法的比較32 結(jié)果與分析32.1 車前草總黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn)32.1.1乙醇濃度對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響32.1.2料液比對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響42.1.3 微波時(shí)間對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響42.1.4 微波功率對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響52.1.5 水浴溫度對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響52.1.6 水浴時(shí)間對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響62.2 正交實(shí)驗(yàn)62.3 常規(guī)提

7、取法與微波輔助提取法比較73 討論7參考文獻(xiàn)：8附表9致謝12前言車前草是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，又名車前、車輪菜、豬耳草、錢串草等,為車前科植物車前或平車前的干燥全草。連花莖高達(dá)50厘米，具須根。生長(zhǎng)在山野、路旁、花圃、河邊等地。根莖短縮肥厚，密生須狀根。葉全部根生，葉片平滑，廣卵形，邊緣波狀，間有不明顯鈍齒，主脈五條。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)藥理研究表明，車前全草中主要有效成分為烏蘇酸、車前苷、環(huán)烯醚甙類成分，其中環(huán)烯醚甙類包括桃葉珊瑚甙、梓醇、京尼平甙酸、蜜特力甙等；黃酮類如車前甙、黃芩素等；此外還古有生物堿、蛋白質(zhì)、氨基酸、大量脂肪酸類、固醇類及酚酸類，在提高人體免疫能力、抗衰老、抑制腫瘤、補(bǔ)五臟虛勞

8、、改善糖尿病癥狀和萎縮性胃炎等方面有明顯療效1。黃酮類化合物是一類存在于植物中的天然產(chǎn)物，在自然界中廣泛分布，是目前倍受關(guān)注的天然活性產(chǎn)物之一。黃酮類化合物又稱生物類黃酮，是色原酮或色原烷的衍生物，以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素?？煞譃辄S酮類、異黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類等，廣義的范圍還包括查耳酮、異黃烷酮、雙黃酮及茶多酚2。黃酮類化合物具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抗氧化，降血脂，抑制血小板凝聚，在生物體內(nèi)有預(yù)防心血管疾病，防癌抗癌，調(diào)節(jié)免疫，抗衰老，抗菌殺菌，提高記憶力，抗過敏，利膽等諸多藥理作用及功效3-4。黃酮類化合物的抗氧化功能與其他外源性抗氧化劑相比，具有無毒、安全

9、和來源廣等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用微波輔助法對(duì)車前草中黃酮類化合物進(jìn)行提取，測(cè)定其粗提物中的黃酮含量，并與普通浸提法相比較，為車前草的開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。1 實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1材料原料：車前草，購(gòu)于漳州市薌城區(qū)北橋市場(chǎng)。1.1.2 試劑蘆丁，無水乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉。1.1.3 儀器HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市江南儀器廠；UV-2102 PC型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LXJ-1IB大容量多管離心機(jī)：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DHG型智能電熱鼓風(fēng)干燥箱（原101系列）：上海成順儀器表有限公司、南通嘉程儀器有限公司合作出品；電子天秤：北京賽

10、多利斯天平有限公司；微波爐。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 樣品處理將新鮮車前草洗凈、清水漂洗并瀝干其表面水分，于（80±1）鼓風(fēng)干燥48 h左右，冷卻后粉碎，過40目篩，裝于試樣瓶中，避光存放、備用。1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制5-6準(zhǔn)確稱取蘆丁對(duì)照8 mg，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至10 mL容量瓶中，得到0.8 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2 0.4 mL，放置6 min后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.3% NaOH 4 mL

11、，加蒸餾水至10 mL，搖勻，放置15 min，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在510 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，以試劑作空白參比，測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度x（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，并求其相關(guān)系數(shù)。以測(cè)定結(jié)果得蘆丁濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=15.488x-0.0858（x：濃度，mg/mL；y：吸光值）R2=0.999，其中蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。圖1 蘆丁濃度吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線1.2.3微波提取條件的優(yōu)化7-8影響車前草總黃酮提取的因素有很多，本實(shí)驗(yàn)首先選擇6個(gè)影響總黃酮提取的主要因素，在單因素試驗(yàn)中，研究了乙醇濃度（50%、60%、70%、80%

12、、90%）、料液比（110、120、130、140、150）、微波時(shí)間（40、60、80、100、120 s）、微波功率（140、280、460、595、700 W）、水浴溫度（50、60、70、80、90 ）、水浴時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）等對(duì)車前草黃酮類化合物提取的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了 L9 (34 )正交試驗(yàn)，并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。1.2.4常規(guī)提取法與微波輔助提取法的比較9 取車前草干粉末3份，每份0.5g，分別放入小燒杯中，按140（g/mL）的比例加入70%的乙醇20 mL，將其放入80 的水浴鍋中回流提取2 h，將提取液進(jìn)行離心后在510 mm下測(cè)

13、其吸光度，計(jì)算出黃酮類化合物的含量，比較常規(guī)提取法與微波輔助提取法的效果。2 結(jié)果與分析2.1 車前草總黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn)2.1.1乙醇濃度對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響由圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，車前草中黃酮類化合物含量增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，總黃酮類化合物含量達(dá)到最高值；再繼續(xù)增加乙醇濃度，總黃酮量逐漸降低。乙醇的濃度低，滲透性小，影響黃酮的析出；乙醇濃度過高可能導(dǎo)致車前草中黃酮被破壞，黃酮含量下降。當(dāng)乙醇濃度在60%80%之間時(shí)，車前草總黃酮量趨于穩(wěn)定，總黃酮量第一、二、三的乙醇濃度為70%、80%、90%。因此，乙醇的最適濃度初步定為70%。圖2 乙醇濃度對(duì)車前草

14、黃酮類化合物含量提取效果的影響2.1.2料液比對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響由圖3可見，料液比為110時(shí)，由于溶劑量過少，可能導(dǎo)致黃酮不能完全被提取，因此黃酮含量較少，隨著料液比增加，達(dá)到140時(shí)，黃酮類化合物的提取量達(dá)到最大值，繼續(xù)增加溶劑的量，黃酮類化合物含量反呈下降趨勢(shì)，可能因?yàn)槿軇┝窟^多而黃酮類化合物含量所占比例下降。車前草總黃酮量隨著料液比的增加而呈現(xiàn)先升高后下降再上升的趨勢(shì)，總黃酮量第一、二、三的料液比為1:40、1:20、1:50。因此，提取的最佳料液比初步定為140。圖3 料液比對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響2.1.3 微波時(shí)間對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的

15、影響由圖4可見，隨著微波處理時(shí)間的增加，提取液溫度也隨著增加，黃酮類化合物含量也相應(yīng)增加，黃酮類化合物提取率上升，當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到80s時(shí)，黃酮類化合物含量達(dá)到最大，當(dāng)微波時(shí)間超過80s后，隨著微波時(shí)間的增加，黃酮含量呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)槲⒉〞r(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致提取液溫度過高，黃酮類化合物受到破壞所致。車前草總黃酮量隨著提取時(shí)間的增加而呈現(xiàn)較大的上下波動(dòng)，總黃酮量第一、二、三的提取時(shí)間為80 s、120 s、100 s。因此，微波處理時(shí)間初步定為80s。圖4 微波時(shí)間對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響2.1.4 微波功率對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響由圖5可見，隨著微波功率的增加，黃酮類化

16、合物含量增加，當(dāng)微波功率達(dá)到700W時(shí)，黃酮類化合物達(dá)到最大值。車前草總黃酮量隨著提取溫度的增加呈現(xiàn)較穩(wěn)定的上升，總黃酮量第一、二、三的提取功率為700W 、595W、460W。因此，提取的最佳微波功率初步定為700W。圖5 微波功率對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果影響2.1.5 水浴溫度對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響由圖6可見，水浴溫度在5090的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，黃酮類化合物的提取量逐漸增加，但增加趨勢(shì)不明顯，水浴溫度超過80，黃酮類化合物含量呈下降趨勢(shì)，原因可能是水浴溫度過高，導(dǎo)致車前草中的黃酮被破壞，含量減少。因此，浸提的最佳水浴溫度初步定為80。但由于水浴溫度對(duì)黃酮類化

17、合物的浸提影響不大，因此在正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝時(shí)，水浴溫度不作為考慮因素。圖6 水浴溫度對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響2.1.6 水浴時(shí)間對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響由圖7可見，水浴時(shí)間在0.51h段內(nèi)，黃酮類化合物含量緩慢增加，12.5h段，黃酮類化合物含量有所增加，但增幅不大，可知，當(dāng)水浴時(shí)間為1.5h時(shí)，車前草中黃酮類化合物已可以大量浸提。因此，最佳水浴浸提時(shí)間定為1.5h。由于水浴時(shí)間對(duì)浸提車前草中黃酮類化合物影響不大，因此在正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝時(shí)，水浴時(shí)間不作為考慮因素。圖7 水浴時(shí)間對(duì)車前草黃酮類化合物含量提取效果的影響2.2 正交實(shí)驗(yàn)由于水浴溫度和水浴時(shí)

18、間對(duì)車前草中黃酮類化合物的浸提效果影響較小，因此在正交試驗(yàn)中不作為考慮因素，在乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間4個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表（表1），正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。表1 因素水平表水平A乙醇濃度（%）B料液比（g/mL）C微波功率（W）D微波時(shí)間（s）12360708030405046059570080100120表2 L9 (34 )正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果試驗(yàn)號(hào)A乙醇濃度（%）B料液比（g/mL）C微波功率（W）D微波時(shí)間（S）總黃酮得率（%）123456789K1K2K3kkkR11122233372.617872.791069.759124.205924.26

19、3623.25301.010612312312367.987176.342671.838122.662325.447523.94602.785212323131272.365572.791072.011424.121824.263624.00380.259912331223178.909569.326069.932426.303123.108623.31083.194523.570723.303223.743922.444627.295623.050920.971923.743925.0433比較表2的三個(gè)因素的極差R，D的極差最大，其次是B，再次為A，而C的極差最小。因此乙醇濃度、料液比、微

20、波功率、微波時(shí)間4個(gè)因素對(duì)黃酮類化合物提取率影響的順序依次為：微波時(shí)間料液比乙醇濃度微波功率。以實(shí)際黃酮得率為指標(biāo)，最佳提取條件組合為A2B2C3D1，即乙醇濃度70%、料液比140、微波功率700W、微波時(shí)間80s。在最佳提取工藝條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，以考察最佳條件的合理性和可靠性，結(jié)果表明，在最佳提取條件（A2B2C3D1）下，3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果非常接近，平均提取率為27.32%。此結(jié)果相比單因素實(shí)驗(yàn)中所有提取率都高，說明該提取工藝穩(wěn)定，適合于提取車前草中黃酮類化合物。2.3常規(guī)提取法與微波輔助提取法比較按1.2.4設(shè)計(jì)的常規(guī)提取法提取車前草黃酮類化合物，結(jié)果顯示，常規(guī)提取法得到的

21、黃酮類化合物的含量為23.48%，而微波輔助提取發(fā)得到黃酮類化合物含量為27.32%。因此，微波輔助提取法不但節(jié)約了時(shí)間，而且效果優(yōu)于常規(guī)提取法，所以微波輔助提取法是很好的提取車前草黃酮類化合物的方法。3 討論進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須保證只有一個(gè)變量，剩余其他因素均不變，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在進(jìn)行水浴加熱時(shí)，每個(gè)燒杯均用保鮮膜封住杯口，保證水浸沒燒杯內(nèi)的溶液且受熱均勻。做好防護(hù)措施，防止燒杯傾倒。在進(jìn)行微波加熱時(shí)，每個(gè)燒杯均用保鮮膜封住杯口，用橡皮筋套住，利用間隔微波的方式進(jìn)行，防止因加熱過快導(dǎo)致液體劇烈沸騰沖出燒杯。本研究結(jié)果表明，乙醇濃度、料液比、微波功率、微波時(shí)間4因素對(duì)車前草黃酮類化合物

22、提取的影響主次順序?yàn)椋何⒉〞r(shí)間料液比乙醇濃度微波功率，而最佳提取條件為A2B2C3D1，即乙醇濃度70%、料液比140、微波功率700W、微波時(shí)間80s。在此條件下，車前草中黃酮類化合物的提取率為27.32%。而常規(guī)法提取率只有23.48%，說明微波輔助提取法的效果明顯優(yōu)于常規(guī)提取法。目前，黃酮類化合物的各種性質(zhì)研究越來越多，如果通過改進(jìn)提取方法，車前草中總黃酮含量得到提高，那么就能為社會(huì)提供更多的幫助，并取得人們的信賴。若能繼續(xù)研究獲得更多的數(shù)據(jù)支持，就能應(yīng)用到更多的領(lǐng)域，這是一個(gè)很好的前景。參考文獻(xiàn)：1劉艷輝，趙映.車前草中黃酮類化合物的提取及其含量的測(cè)定J.湖南理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2009,2

23、2（2），63-64.2耿敬章,馮君琪. 黃酮類化合物的生理功能與應(yīng)用研究J.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2007,7:19-21.3黃河勝,馬傳庚,陳志武. 黃酮類化合物藥理作用研究進(jìn)展J.中國(guó)中藥雜志,2000,25 (10):499-562.4王瑋,王琳. 黃酮類化合物的研究進(jìn)展J.沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,4(2):115-119.5 房方,張廣強(qiáng),謝新年.用分光光度法進(jìn)行黃酮類化合物含量測(cè)定的研究J.河南中醫(yī)藥學(xué)刊,1997,12(1):17-19.6陳金娥，匡強(qiáng)民，張海容.正交優(yōu)化-微波輔助提取銀杏葉黃酮J.光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28(2):623-626.7王向國(guó).良姜總黃酮提取工藝研究J中

24、國(guó)野生植物資源,2010,29(4):47-49.8連建國(guó),孟慶杰,王光全,張凱.山楂新品種黃酮的提取與分析J.山東林業(yè)科技,2010,191(6):12-14.9梅洪睿,云霞,楊紅.回歸正交試驗(yàn)法優(yōu)化菜芙蓉莖中總黃酮的提取工藝J.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008(4):297-300.10李盈蕾,陳建華，陳亞洲.槲寄生總黃酮微波提取工藝及其抗氧化活性研究J.食品科學(xué),2010,31(12):62-66.附表表1 標(biāo)準(zhǔn)盧丁濃度的吸光度盧丁濃度（mg/mL） 吸光度A0.016 0.1730.032 0.4030.048 0.6530.064 0.8910.080 1.168表2 乙醇濃度對(duì)車前草總黃

25、酮提取率的影響管號(hào)草質(zhì)量（g）乙醇濃度（%）料液比（g：ml）水浴時(shí)間（分鐘）水浴溫度（）微波時(shí)間（s）微波功率（W）吸光值A(chǔ)黃酮量（mg/g）10.5501:306080402800.17217.3336820.5601:306080402800.18618.5464330.5701:306080402800.22822.1846840.5801:306080402800.22121.5783150.5901:306080402800.19819.58593表3 料液比對(duì)車前草總黃酮提取率的影響管號(hào)草質(zhì)量（g）乙醇濃度（%）料液比（g：ml）水浴時(shí)間（分鐘）水浴溫度（）微波時(shí)間（s）微波功率

26、（W）吸光值A(chǔ)黃酮量（mg/g）10.5701:106080402800.21420.9719320.5701:206080402800.25624.6101930.5701:306080402800.24423.5106940.5701:406080402800.26825.6496950.5701:506080402800.25324.35031表4微波時(shí)間對(duì)車前草總黃酮提取率的影響管號(hào)草質(zhì)量（g）乙醇濃度（%）料液比（g：ml）水浴時(shí)間（min）水浴溫度（）微波時(shí)間（s）微波功率（W）吸光值A(chǔ)黃酮量（mg/g）10.5701:306080402800.20520.1923120.5701

27、:306080602800.22321.7515630.5701:306080802800.25624.6101940.5701:3060801002800.23322.6178150.5701:3060801202800.23823.05094表5微波功率對(duì)車前草總黃酮提取率的影響管號(hào)草質(zhì)量（g）乙醇濃度（%）料液比（g：ml）水浴時(shí)間（min）水浴溫度（）微波時(shí)間（s）微波功率（W）吸光值A(chǔ)黃酮量（mg/g）10.5701:306080401400.21921.4050620.5701:306080402800.22121.5783130.5701:306080404600.24623.7439440