外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)進(jìn)展

1、外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)進(jìn)展主要內(nèi)容主要內(nèi)容循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的意義循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的意義循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的基本原理循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的基本原理納米材料技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用納米材料技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用微流控技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用微流控技術(shù)在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用循環(huán)腫瘤細(xì)胞循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTCs）1896年年Ashworth在患者外周血中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細(xì)在患者外周血中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細(xì)胞胞 體積和形態(tài)相似的細(xì)胞；體積和形態(tài)相似的細(xì)胞；目前目前CTCs定義為自發(fā)或因診療操作脫離實(shí)體瘤原發(fā)定義為自發(fā)或因診療操作脫離實(shí)體瘤原

2、發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血循環(huán)的一類腫瘤細(xì)胞。灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入外周血循環(huán)的一類腫瘤細(xì)胞。 Ashworth TR. Aust Med J, 1869, 14: 146-147Allard WJ, Matera J, Miller MC, et al. Clin Cancer Res, 2004, 10: 6897-6904研究研究CTCs的臨床意義的臨床意義 TNM分期的重要補(bǔ)充分期的重要補(bǔ)充 療效監(jiān)測和預(yù)后判斷療效監(jiān)測和預(yù)后判斷 個(gè)體化治療的指導(dǎo)個(gè)體化治療的指導(dǎo) 轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)警轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)警 血循環(huán)轉(zhuǎn)移的機(jī)制血循環(huán)轉(zhuǎn)移的機(jī)制TNM分期的重要補(bǔ)充分期的重要補(bǔ)充CTCs的臨床意義的臨床意義療效

3、監(jiān)測和預(yù)后判斷療效監(jiān)測和預(yù)后判斷CTCs的臨床意義的臨床意義個(gè)體化治療的指導(dǎo)個(gè)體化治療的指導(dǎo)CTCs的臨床意義的臨床意義轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)警轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)警CTCs的臨床意義的臨床意義血循環(huán)轉(zhuǎn)移的機(jī)制血循環(huán)轉(zhuǎn)移的機(jī)制CTCs的臨床意義的臨床意義CTCs特點(diǎn)特點(diǎn) 外周血含量低：110個(gè)CTC/mL血液1 個(gè)CTC/109 個(gè)血細(xì)胞； CTCs特性、形態(tài)及細(xì)胞標(biāo)志隨著內(nèi)環(huán)境改變而改變，無統(tǒng)一鑒定標(biāo)準(zhǔn)。CTC的的檢測步檢測步驟驟檢測檢測富集富集以特異性抗體經(jīng)抗原抗體吸附篩選根據(jù)細(xì)胞大小進(jìn)行富集免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合納米材料物理學(xué)免疫學(xué)免疫/化學(xué)CTC富集方法富集方法免疫磁性分離免疫磁性分離陽性選擇法陽性選

4、擇法MACS、Cellsearch系統(tǒng)以及系統(tǒng)以及CTC-Chip陰性排除法陰性排除法CD45磁珠去除白細(xì)胞（磁珠去除白細(xì)胞（IMB法）法）抗原抗體吸附篩選抗原抗體吸附篩選 光鏡下(放大倍數(shù)400倍)免疫磁珠吸附目標(biāo)細(xì)胞分子生物分子生物學(xué)方法學(xué)方法(PCR)CTC檢測檢測免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)方法化學(xué)方法(ICC(ICC、 EPISPOT)EPISPOT)流式細(xì)流式細(xì)胞技術(shù)胞技術(shù)CellTracks AutoPrep SystemCellSearch 檢測CTCs 流程圖1 1、不同腫瘤表面抗體的表達(dá)量存在差異、不同腫瘤表面抗體的表達(dá)量存在差異 2 2、腫瘤發(fā)展過程中細(xì)胞的去上皮化、腫瘤發(fā)展過程

5、中細(xì)胞的去上皮化 CTC研究現(xiàn)狀研究現(xiàn)狀磁珠體積很小，不損傷細(xì)胞、不影響細(xì)胞功能、磁珠體積很小，不損傷細(xì)胞、不影響細(xì)胞功能、不影響細(xì)胞的特異染色不影響細(xì)胞的特異染色( (細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核核) )，顯微鏡下可直接觀察或計(jì)算機(jī)計(jì)數(shù)。，顯微鏡下可直接觀察或計(jì)算機(jī)計(jì)數(shù)。前期應(yīng)用微米磁珠，比表面積小、尺寸大、穩(wěn)定前期應(yīng)用微米磁珠，比表面積小、尺寸大、穩(wěn)定性差、易聚沉，致細(xì)胞分離效率低，難洗脫并保性差、易聚沉，致細(xì)胞分離效率低，難洗脫并保持細(xì)胞活性；持細(xì)胞活性；檢測成本高、樣品用量多、樣品檢測時(shí)間長、檢檢測成本高、樣品用量多、樣品檢測時(shí)間長、檢測過程封閉等諸多不足測過程封閉等諸多

6、不足納米技術(shù)增大比表面積，分散性好，降低機(jī)械壓納米技術(shù)增大比表面積，分散性好，降低機(jī)械壓力，提高富集率力，提高富集率 CTC方法學(xué)現(xiàn)狀方法學(xué)現(xiàn)狀納米技術(shù)納米技術(shù) 納米科技是指在納米尺度(從單個(gè)原子、分子到亞微米尺度之間)上研究物質(zhì)特性和相互作用，以及由納米結(jié)構(gòu)集成的功能系統(tǒng)。以此可獲得結(jié)構(gòu)可控、表面功能化的納米材料和納米結(jié)構(gòu)； 納米材料具有一些獨(dú)特的效應(yīng)，包括小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、界面效應(yīng)以及宏觀量子遂道效應(yīng)，使納米材料在性能上與具有相同組成的傳統(tǒng)概念上的微米材料有非常顯著的差異，表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能；納米技術(shù)增大比表面積，分散性好，降低機(jī)械壓納米技術(shù)增大比表面積，分散性好，降

7、低機(jī)械壓力，提高富集率。力，提高富集率?；诜谴判约{米材料的基于非磁性納米材料的CTC 富集富集基于納米材料修飾表面將抗體功能化的不同形狀的納米材料(納米顆粒、納米線等)提高了細(xì)胞與捕獲靶點(diǎn)的接觸幾率、方便將CTC 細(xì)胞從表面洗脫，減少納米顆粒吸附對于細(xì)胞活力和分析檢測的影響Sekine J, et al. Adv Mater, 2011, 23 (41):4788-4792Zhang N, et al. Adv Mater, 2012, 24 (20):2756-2760基于非磁性納米材料的基于非磁性納米材料的CTC 富集富集基于納米結(jié)構(gòu)表面腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在粗糙表面上具有不同的黏附特性，

8、利用納米粗糙表面(如功能化的納米線、納米柱)分離血液中的CTCChen W Q,et al. ACS Nano, 2013, 7 (1): 566-575Hou S, et al. Adv Mater, 2013, 25(11): 1547-1551微流控技術(shù)微流控技術(shù) 微流控技術(shù)是一種針對極小量(10-910-18 L)流體進(jìn)行操控的系統(tǒng)科學(xué)技術(shù); 微流控芯片是微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)的主要平臺和技術(shù)裝置，其主要特征是容納流體的有效結(jié)構(gòu)(通道、反應(yīng)室和其他某些功能部件)至少在一個(gè)維度上為微米級尺度。納米技術(shù)與微流控技術(shù)結(jié)合納米技術(shù)與微流控技術(shù)結(jié)合CTC-chips納米技術(shù)與微流控技術(shù)結(jié)合納米技術(shù)與微流

9、控技術(shù)結(jié)合磁性納米材料與微流控結(jié)合用于CTC 富集；非磁性納米材料與微流控結(jié)合用于CTC富集。磁性納米材料與微流控結(jié)合 與CellSearchTM原理類似； 微流控芯片的樣品量小、流速可控及構(gòu)件透明； 磁珠用量減少25%。非磁性納米材料與微流控結(jié)合第二代第二代CTC-chipsA) The HB-Chip consists of a microfluidic array of channels with a single inlet and exit. Inset illustrates the uniform blood flow through the device. (B) A micr

10、ograph of the grooved surface illustrates the asymmetry and periodicity of the herringbone grooves. Cartoon illustrating the cell-surface interactions in (C) the HB-Chip, and (D) a traditional flat-walled microfluidic device. Flow visualization studies using two paired streams of the same viscosity

11、(one stream is green, the other clear) demonstrate (E) the chaotic microvortices generated by the herringbone grooves, and the lack of mixing in (F) traditional flat-walled devices. 舊方法舊方法: :病人血液樣本通過一種表層涂有抗體的硅芯片，該抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，血液平滑流過microposts限制了與抗體覆蓋層的接觸。新方法：新方法：將血液標(biāo)本經(jīng)過一個(gè)人字形溝槽，可快速混合液體，并產(chǎn)生一個(gè)更亂的血流，顯著增加捕獲

12、細(xì)胞的數(shù)量。Toner M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010，107(43):18392-7HB-chipsBlood from metastatic prostate cancer patients and healthy donors was processed using the HB-Chip. (A) Healthy donors (n = 10, red circles) were used to select the signal intensity threshold in our automated imaging system (

13、19). The metastatic prostate cancer patient data (n = 15, green circles) had significantly higher results, with 14 15 patient samples presenting CTCs above-threshold levels. Additionally, (B) the TMPRSS2-ERG fusion transcript was detected from RNA isolated from the HB-Chip, using RT-PCR. Sequencing

14、of the gel band identified the rare gene fusion of TMPRSS2 exon 1 and ERG exon 5. (C and D) Micrographs of CTCs isolated from patients with metastatic prostate cancer costained using antibodies against PSA (green), a leukocyte marker, CD45 (red), and a nuclear stain (DAPI). Corresponding micrographs of the same cells are shown to the right of the fluorescent images, demonstrating their appearance after subsequent staining with H and E. (Scale bars: 10 m). Toner M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010，107(43):18392-7Toner M, et al. Proc Natl Acad