一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體及其制備方法

1、種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體及其制備方法1"一種聚苯乙烯甚質(zhì)檢嚴(yán)固和有機(jī)合成栽體*耳特tit在于.它繪將齟甲基聚苯乙烯莪體與3-輒亦1«4、-二甲氧三苯甲基卜12丙二醉通過號(hào)旳幡驢偶聯(lián)得到的固相朝偽具有如下結(jié)構(gòu)式：英中.PS為聚苯乙烯找體，DMT為4彳-二甲軟三苯甲莖.2-艸聚基乙烯華質(zhì)核啟固相有機(jī)合成載體的制備方法，包含如卜涉驟：在沐度為0.l-5.0mnioVg的催叱劑存在條件下，聚苯乙烯義體與忖隸甲基鄰苯二甲離亞陵在有機(jī)澹液中反應(yīng)，得到鄰苯二甲酰亞胺甲砥聚苯乙烯載體；小郭苯一甲酰亞肢甲基聚睪乙擁鞍體邛報(bào)用為？30%胖的乙醉髀液中反應(yīng).得到氨甲蘋聚苯乙烯載體*U甲

2、星聚苯乙烯載體與琥旳酸酊在有機(jī)溶液中反應(yīng)得到琥珀酰胺甲基聚縈乙烯載體*(d) <QM用痕丨.琥用醜胺甲赫苯ZJMt體與3-氨墓彳4*仁_甲氧三笨田基H2-丙二辭間臂在濃度為i-JOmmoVgl+的催化刑催化F于室溫反應(yīng)，得到如權(quán)利聲求I所述聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)含成栽體.二如權(quán)利姿求2所述的制冬方法，具中所慢用的有機(jī)溶刑為一凱甲住“期氫咲喃、MbT-二甲甚甲醸胺、乙聃、三乙胺、毗咗、2上二甲基毗喘中的一種或幾種的混合溶劑.4如權(quán)和要求2所述的制備方法.其中所使用的冇機(jī)涪劑的嚴(yán)為2100mL,更優(yōu)選的是4. 5<hnL=5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中的反應(yīng)時(shí)問為278h,更

3、優(yōu)選的是224爪6. 如權(quán)利亞求2所逑的制備方法，其中的反應(yīng)溫浚為室溫80©7. 如叔利要求2所述的制備方法步鎳Ca)所鍥出的聚苯乙烯載體DWi交聯(lián)度為15%.鬼優(yōu)選的是1怖孑僵如權(quán)利要求2所述的制無方注步驟(G所便用的聚苯乙堺載休粒徑范圍為20】OOgm也優(yōu)選的是m卜hoc屮m9, 如杞利要求2所述的制備方法，步驟5所使用的催化劑是甲基硝酸、図猛化錫、包範(fàn)酸.二瓠化欽、二氯化tv二苓甲銅、砒基甲烷中的種*10. 如權(quán)利豐求2所込的制備方法步驥(3)所便用的催化劑的用星為0.l-5.Qnunol/E體,更優(yōu)選的是0.2-2.0mmol/g載體。1】.如權(quán)利耍求2所述的制備方法，步驟（

4、a）所使用的N氯甲基鄰苯二甲酰亞胺的用量為0.25.0mmol/g朝體，更優(yōu)選的是0.52.0mmol/g載體.12.如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟（b）所使用的腓的乙醇溶液的濃度為330%,更優(yōu)選的是5%15%.如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟（b）所使用的腓的乙腫溶液的用毎為550mL/g載體，更優(yōu)選的是10-25mL/g體.14如權(quán)利雯求2所述的制備方法，步驟（c）所便用的琥珀酸軒的用量為0.510nunol/g載體,更優(yōu)選的是l5mmol/g載體?！?如權(quán)利娶求2所述的制備方法，步驟（d>所使用的3気基-1<4,4-二甲氣三苯甲基）1,2丙二醉間借的用屋為0.5lOmmo

5、l/g祓體，更優(yōu)選的是l5mmol/g我體。16. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟（d）所使用的備化劑種類為1疑基苯并三畔、N.N*二環(huán)己基碳二亞胺、N,NT二異丙菇碳二亞胺中的一種或幾種的混合物.17. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，步驟（d）所使用的催化劑的用量為I10mmo"g載體，更優(yōu)選的是25mmol/g載體。1&如權(quán)利要求1所述的核駿固相有機(jī)合成載體，其特征在于，所述的載體載呈大于60pmol/g,偶聯(lián)效率大于95%19.如權(quán)利要求1所述的核酸固相有機(jī)合成載體，其特征在于，所鳳的載體能夠満足不同序列孩酸合成的需要，是一種通用型的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成戲體。一

6、種聚苯乙妳基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成較體及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域克發(fā)明涉及核酸固相有機(jī)報(bào)體及其制備方法，更具體的說，趕涉及一種通用空聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成教體及其制備方法。背景技術(shù)核酸固相有機(jī)合成足將固相合成和亞磷戰(zhàn)胺濃相結(jié)合，借助于商品化的DNA/RNA合成儀(如ABI公司的392DNA/RNA合成儀或GE公司的KTAoligopilotDNA/RNA合成儀)，在固相較休上依次按曲核酸序列進(jìn)行偶聯(lián).實(shí)現(xiàn)快連.高效、穩(wěn)定的核酸合成.由于囲相有機(jī)合成貝有自動(dòng)化程度高、產(chǎn)物金大、沒有序列限制、合成產(chǎn)物易進(jìn)行化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)，因此足目前獲得人量核酸最主要的途徑之一.目前大多數(shù)核酸固相載體均是在可控孔度玻璃

7、(CPG)載體上連接目標(biāo)核酸的起始核昔單體，以此提供核酸序列桁生的活性位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上依次進(jìn)行目標(biāo)序列的合成，如Sigma公可的核酸合成系列我體就是將CPG與核昔單體通過琥珀酸健連接得到的,CPG上核昔單體作為合成核酸序列的起始核昔.除琥珀酸鍵外，還有一些化學(xué)間骨也能用于連接CPG和起始孩昔單體，如Ahil和Pon分別采用乙二酰鍵和對(duì)苯二酚O,CT乙酰乙酸卑作為連接間習(xí)，得到了不同的CPG固相有機(jī)合成找體(Alul.NucleicAcidsRcscarch(19):1527(1991)：Pon.NucleicAcidsResearch(25):3629-3635(1997)#CPG作為一種無機(jī)

8、硅氧基載體，具有表面易衍生、反應(yīng)活性較高、不溶脹等優(yōu)點(diǎn)，但由于其表面富含脛基，親水性較強(qiáng)，且其保護(hù)基在合成過程中易脫落，定程度上影響了核酸的合成效率和質(zhì)就.此外，傳統(tǒng)的固相載體根據(jù)連接的起始孩甘(A、T、C、G、U)分為不同的那矣.耍満足不同序列的合成要求需備齊全部種類的固相載體.提高了試驗(yàn)成本和工作蜃。聚苯乙烯(PS)是一種性能優(yōu)異的有機(jī)載體，McCollumC等利用甲基聚苯乙烯偶聯(lián)核昔單體琥珀駿衍牛物作為固相有機(jī)合成戰(zhàn)體進(jìn)行DNA的合成，取得了較好的合成效果(McCollum,TetrahedronLcttcre32:4069-4072(1991)聚苯乙烯表面疏水，通過無水溶劑的淋洗能夠徹

9、底除去我面的殘留水分，減少水分對(duì)孩酸合成的干擾.其表血經(jīng)過氨基衍生后活性位點(diǎn)相對(duì)較少，核酸合成過程中不易產(chǎn)生錯(cuò)誤序列，產(chǎn)物純度較閒.針對(duì)傳統(tǒng)載體芳分類的問題，Lyttle等開發(fā)了一類以CPG為基質(zhì)的通用較體，它僅提供孩酸合成的位點(diǎn)(活性咒基)而不連接足始核音，能夠滿足不同核酸序列合成，解決了固相載體分類的麻煩(Lylllc.NucleicAcidsResearch24:2793-2798(1996)Nelson等也開發(fā)了一種名為“Rainbow”的通用CPG截體，合成性能也相當(dāng)優(yōu)異(Nelson,BioTechniques22:752-759(1997)本發(fā)明將氨甲基聚苯乙烯與3-氮基-1-(

10、4,4*-甲氧三覃屮基)1,2.丙二醇通過琥珀酸鍵連接，制備了一種通用型的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成戟體。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的日的在于提供一種核酸固相有機(jī)合成戲體.本發(fā)明的目的還在于提供一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體，它載雖奇于傳統(tǒng)載體，能夠滿足各種核酸序列的合成需雯，具有較好的合成性能。本發(fā)明的目的還在于提供一種核酸固相有機(jī)合成載體的制備方法。本發(fā)明的冃的還在于提供一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體的制備方法.本發(fā)明握供的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成栽體，它足將氨甲基衍生的聚苯乙烯載體通過琥珀酸鍵與3氮Jt-l-(4,4*-二甲氣三苯甲M)-l,2-丙二腫偶聯(lián)徇到的固相載體。載體的載雖

11、大于60Pmol/g載體，合成反應(yīng)中毎步偶聯(lián)效率大于95%.同時(shí)，它具有通用性，能夠滿足各種核般序列的合成需要。本發(fā)明還提供了一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體的制備方法，包括以卜涉驟：(a) 在濃度為0.15.0mmol/g載體的催化劑存在條件下，聚苯乙烯我體與N氯甲基鄰苯二甲酰亞胺在有機(jī)溶液中反應(yīng)，得到鄰苯二甲酰亞胺甲產(chǎn)聚苯乙烯載;體；(b) 鄰苯二甲酰亞胺甲基聚苯乙烯戦體在濃度為330%臍的乙俾溶液中反應(yīng)，得到氨甲基聚苯乙烯較體；(c) 氨甲基聚苯乙烯載體與琥珀酸酊在有機(jī)溶液中于宅溫反應(yīng)，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯我體：(d) 在有機(jī)溶液中，琥珀醸胺甲基聚苯乙烯載;體與3-氨基-1-(4

12、,4，.二甲氧三苯甲基卜12丙二醉間臂在濃度為110mmol/g戟體的催化劑催化下于室溫反應(yīng)，得到所述核酸固相有機(jī)谷成載體。上述制備方法中，所使用的聚苯乙烯載體二乙烯基苯交聯(lián)度為0.5%15%,更優(yōu)選的圧1%3%；我體粒徑范圍為20lOOOym,更優(yōu)選的是30300pm；所使用的有機(jī)溶劑為二氯甲烷、四氫咲喃、N,N»二甲基甲酰胺、乙席、三乙胺、毗碇、2,6二甲基毗碇中的一種或幾種的混合溶劑：有機(jī)溶劑的用雖2lOOmL,更優(yōu)選的足450mL：反應(yīng)時(shí)間為278h,更優(yōu)選的是224h：反應(yīng)溫度為室溫-80*C.上述制備方法中，步驟(a)中所使用的催化劑為甲基碩酸、四氯化錫、氫氟酸、三氯化鐵

13、、三氯化鐵二苯甲酮、歸基甲烷中的一種：催化劑用雖為0.15.0mmol/g載體，更優(yōu)選的是0.22.0mmo"g載體；N氯甲基鄰苯二甲酰亞胺的用最為0.25.0mmol/g載體，史優(yōu)選的是0.52.0mmol/g載體.匕述制備方法中，步驟(b)中所使用的耕的乙醇溶液的濃度為330%,更優(yōu)選的足5%15%：用斌為550mL/g載體.更優(yōu)選的是1325mL/g馥體.上述制備方法中，步驟(c)中琥珀酸fiT的用量為0.5lOmmol/g載體，更優(yōu)選的足卜5mmo"g載體。上述制備方法中，步驟(d)中我體與間習(xí)偶聯(lián)時(shí)，3.氨.基亠(4/T二甲氧三苯甲基)4,2丙二醇間臂的用雖為0.

14、5-!0minul/g體，吏優(yōu)選的足15mmol/g載體；反應(yīng)所用的催化刑為1劣基苯并三哇、N,N'二環(huán)己基碳二亞胺、N,N，二異丙基碳二亞胺中的一種或幾種的混合物:催化劑用最為110n】mol/g載體，更優(yōu)選的是25mmol/g載體.本發(fā)明公開的制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：L本發(fā)明提供了一種聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體的制備方法，并得到了-種合成性能優(yōu)良的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體。2. 本發(fā)明制備的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體裁量大于60Mmo1/g,高于傳統(tǒng)載體3. 本發(fā)明制備的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體能夠滿足各種核酸序列的合成需要，具有通用性.4

15、. 本發(fā)明的操作方法簡單易行，反應(yīng)條件溫和，易于工業(yè)化的放大生產(chǎn)。具體實(shí)施方法下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不僅僅限制于該實(shí)施例中.實(shí)施例丨5.0g3-氨基-1,2丙二醇加入50mL三氟乙酸甲酯中，爼溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h,反應(yīng)結(jié)束后蒸憶除去三氛乙酸甲酯，得油狀產(chǎn)物3三氟乙酰K-L2-丙二醇，產(chǎn)物經(jīng)紅外檢測結(jié)構(gòu)正確，離子阱質(zhì)譜檢測分子量為187.2,與理論值相符。3.0g3-三氟乙酰胺1.2丙二醇加入50mL毗曉中，攪拌同時(shí)加入4.5gDMT-CI,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h,加入2mL甲醇終止反應(yīng)。蒸憎除去溶劑,產(chǎn)物用硅膠柱色譜純化得到淡黃色油狀產(chǎn)物3三氟乙酰胺-l-DMT-1,2-丙二醇

16、，產(chǎn)物紅外檢測結(jié)構(gòu)正確，離子阱質(zhì)譜檢測分子最為489.1,與理論值相符.2.5g3三氟乙酰胺亠(4,4-二甲氣三苯甲基).1,2內(nèi)二酢溶于1OOmL6M氨的甲醉溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10h,煤卡得無色油狀產(chǎn)物3.氨基-l-DMT-1,2-,收率90%,HPLC檢測純度為96.5%,產(chǎn)物紅外檢測結(jié)構(gòu)正確，離子阱質(zhì)譜檢測分子量為393.2,與理論值相符.實(shí)施例2稱取l.Og聚苯乙烯載體(二乙烯基苯交聯(lián)度為2%,粒徑為3080pm),0.15gN-氯甲基鄰苯二甲酰亞肢，20mL二氣甲烷加入茄形瓶中.攪拌加入200mg三氯化鐵作催化劑，25*C攪拌反應(yīng)15h.反應(yīng)結(jié)束后.分別用二氯甲烷(5X10mL),

17、甲W(2X10mL)淋洗載體，真空干燥2h,將干誅后的取體加入10mL10%耕的乙醇溶液中，回流反應(yīng)7h,然后用乙fi$(5X10mL)淋洗，曳空干燥得氮甲基衍生的聚苯乙烯載體.紅外檢測我體結(jié)構(gòu)正確，水楊醛法測載體氮基載皐為0.48mmol/g載體實(shí)施洌3稱取2.5g聚苯乙烯載體(二乙烯基苯交聯(lián)度為1.5%,粒徑為80120pm),2.0gN-氯甲基鄰苯二甲酰亞胺，80ml,二氯甲烷加入茄形瓶中，加入0.5mL甲基磺酸作催化劑，60*C攪拌反應(yīng)I0h反應(yīng)結(jié)束后，分別用N,N，二甲基甲酰胺(3X10mL),甲W(2X10mL)淋洗載體，克空丁燥2h將干燥后的戦體加入50mL12%耕的乙醇溶液中，

18、回流反應(yīng)10h,然后用乙醉(3X10mL),甲fi?(3X10mL)淋洗載體，真空干燥得氨甲基衍生的聚苯乙烯載;體.紅外檢測載體結(jié)構(gòu)正確，水楊醛法測載體氨基載呈為0.89mmol/g載體.實(shí)施例410g氨甲基聚苯乙烯，5.0g琥珀酸軒，l5mL毗陀混合，室溫振蕩24h,須到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯載體。干燥后的載體與2.0g3-氨基-1-DMT-L2-丙二醇0.8g1脛基苯并三咯10mL2,6二甲基毗咤混合，室溫振蕩48h；過濾收集我體，頁空干燥干燥后的載體懸浮于30mL四氫咲喃中，加入5mL甲酸和3mL乙酸時(shí)泯的合物(3h內(nèi)加三次，每次1.5mL)進(jìn)行甲?；?，家溫振蕩8h：用20mL乙月青淋洗載

19、體，真空干燥2h,得所需的核酸固相有機(jī)合成較體.分光光度法檢測DMT載量為128.75nmol/g,實(shí)施例52.0g氨甲基聚苯乙烯，4.0g琥珀腹軒，25mL毗剜昆合，室溫振蕩過夜，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯載體.干燥后的載體與5.0g3.艮基丙二職3.0gN,Z二異丙基碳二亞胺，50mL毗碇混合，室溫振蕩36h；過濾收集載體，真空干燥2h。2.0g我體懸浮于30mL毗碇:四氫咲喃（3:4）中，加入10mL甲酸和6mL乙酸酹泡的合物（5h內(nèi)加三次，每次3mL）進(jìn)行甲?；?，室溫振蕩12h；用30mL四氫吠喃淋洗載體，真空干煉2h,得所需的核酸固相有機(jī)合成載體。分光光度法檢鴻DMT載啟為85.36p

20、mol/g實(shí)施例6利用例4中御到的聚苯乙烯基質(zhì)核酸固相有機(jī)合成載體，合成寡核昔酸片段5'AUUGGCCAUGCUA：F,按照35,的順序依次在載體上偶聯(lián)核昔亞確酰胺單體，合成規(guī)模為】屮nol,每個(gè)偶聯(lián)循環(huán)操作步驟為：（a）DMT保護(hù)基的脫除：反應(yīng)詢，使用無水乙脂充分洗滌反應(yīng)儀器和固相皴體，然后加入0.7mL2%三氯乙酸的二氯甲烷溶液，反應(yīng)60s,使用無水乙睛洗滌除去三氯乙酸和水；（b）偶聯(lián)反應(yīng)：將lOOpLO.lmmol/mL亞磷酰胺單體溶液和）L5乙硫基四氮哇溶液加入反應(yīng)器中，反應(yīng)15min,反應(yīng)結(jié)東后固相載體用無水乙瞞洗滌；（c）封閉反應(yīng)：加入1001.16%N-甲基瞇畔的四氫咲喃溶液和lOOpL10%無水乙酸肝,10%唏喘的四氫咲喃溶液，反應(yīng)5s：（d）氧化反應(yīng)：加入0.5mL碘氧化溶液，反應(yīng)45s,將亞磷酸三酯氧化為穩(wěn)定的磷酸三酯，結(jié)束本偶聯(lián)周期.貳復(fù)偶聯(lián)步驟直至完成核酸片段的合成。合成結(jié)束后，取出載體，加入2M氨的甲醉溶液，20*0反應(yīng)lh,將產(chǎn)物從我體上切割，后加