細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)ppt

1、二在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛二在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)。直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)。用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)和腫瘤學(xué) 等多種學(xué)科研究等多種學(xué)科研究.2.直接觀察細(xì)胞的變化可便于攝影。直接觀察細(xì)胞的變化可便于攝影。3.研究細(xì)胞種類如低等到高等到人類、胚胎研究細(xì)胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。到成體、正常組織到腫瘤。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛4.便于使用各種技術(shù)：相差、熒光、電鏡、組便于使用各種技術(shù)：相差

2、、熒光、電鏡、組化、同位素標(biāo)記等方法觀察和研究化、同位素標(biāo)記等方法觀察和研究細(xì)胞狀況細(xì)胞狀況。5.是是分子生物學(xué)和基因工程學(xué)分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究對象，也的研究對象，也是其主要的組成部分。是其主要的組成部分。6.易于施用易于施用物理、化學(xué)生物物理、化學(xué)生物的實(shí)驗(yàn)研究。的實(shí)驗(yàn)研究。7.易于提供大量易于提供大量生物性狀相似生物性狀相似的實(shí)驗(yàn)對象的實(shí)驗(yàn)對象,耗資耗資少比較經(jīng)濟(jì)。少比較經(jīng)濟(jì)。8.成為生物制品成為生物制品單克隆抗體單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程等生產(chǎn)和基因工程等的材料來源。的材料來源。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 組織和細(xì)胞離體后獨(dú)立生存在人工的組織和細(xì)胞離體后獨(dú)立生存在人工的培養(yǎng)環(huán)境中，雖然模擬體內(nèi)環(huán)

3、境，仍有培養(yǎng)環(huán)境中，雖然模擬體內(nèi)環(huán)境，仍有很大很大差異差異。 因而利用培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)因而利用培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)時(shí)，時(shí)，不應(yīng)視為體內(nèi)細(xì)胞完全相同不應(yīng)視為體內(nèi)細(xì)胞完全相同，把實(shí)，把實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同驗(yàn)結(jié)果推測體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論。的結(jié)論。七七. 細(xì)胞生存環(huán)境、條件和代謝細(xì)胞生存環(huán)境、條件和代謝 培養(yǎng)細(xì)胞生存途徑和物質(zhì)代謝與體內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞生存途徑和物質(zhì)代謝與體內(nèi)細(xì)胞基本相同，隨生存環(huán)境改變出現(xiàn)一細(xì)胞基本相同，隨生存環(huán)境改變出現(xiàn)一定差異。定差異。（一）環(huán)境（一）環(huán)境 培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件。保證細(xì)胞生存環(huán)境無生存的首要條件。

4、保證細(xì)胞生存環(huán)境無任何污染、代謝物及時(shí)清除，是維持細(xì)任何污染、代謝物及時(shí)清除，是維持細(xì)胞生存的基本條件。胞生存的基本條件。 (二二)溫度溫度：人哺乳動(dòng)物：人哺乳動(dòng)物：36.50.5;鳥類：鳥類：38.5; 一般培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力比高溫強(qiáng)溫一般培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力比高溫強(qiáng)溫度上升不超過度上升不超過39時(shí)時(shí), ,細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比。成正比。39401小時(shí)小時(shí), ,受損傷的細(xì)胞可能恢復(fù)；受損傷的細(xì)胞可能恢復(fù)；41421小時(shí)小時(shí), ,嚴(yán)重?fù)p傷嚴(yán)重?fù)p傷, ,個(gè)別細(xì)胞恢復(fù)；個(gè)別細(xì)胞恢復(fù)；43以上以上1小時(shí)小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。，細(xì)胞全部死亡。溫度不低于溫度不低于0時(shí)時(shí), ,細(xì)胞

5、代謝有影響細(xì)胞代謝有影響, ,無傷害作用無傷害作用; ;置于置于 2535，細(xì)胞能生存，但生長速度減慢；細(xì)胞能生存，但生長速度減慢；放在放在 4 數(shù)小時(shí)數(shù)小時(shí), ,再放回再放回 37 細(xì)胞仍繼續(xù)生長。細(xì)胞仍繼續(xù)生長。細(xì)胞代謝隨溫度降低而緩慢，溫度降至冰點(diǎn)以下細(xì)胞代謝隨溫度降低而緩慢，溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí)時(shí), ,細(xì)胞因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。細(xì)胞因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。 (三三)氣體環(huán)境和氫離子濃度氣體環(huán)境和氫離子濃度氣體氣體：氧氣和二氧化碳氧氣和二氧化碳 氧氣氧氣:參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種所需成分。增殖和合成各種所需成分。氧氣分壓氧氣分壓1

6、99589975Pa,適用于封閉式單層適用于封閉式單層細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng);開放式培養(yǎng)開放式培養(yǎng)(碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng))細(xì)胞置于細(xì)胞置于95空氣加空氣加5二氧化碳二氧化碳混合氣體環(huán)境中?；旌蠚怏w環(huán)境中。 CO2 : 細(xì)胞代謝產(chǎn)物細(xì)胞代謝產(chǎn)物,也是細(xì)胞所需成分。其主也是細(xì)胞所需成分。其主要作用維持培養(yǎng)基要作用維持培養(yǎng)基的的pH值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH7.27.4，偏離此范圍對細(xì)胞將產(chǎn)生有害的偏離此范圍對細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。影響。有些細(xì)胞存在差異。如有些細(xì)胞存在差異。如羊水細(xì)胞羊水細(xì)胞培養(yǎng)檢測染色培養(yǎng)檢測染色體時(shí)體時(shí)pH為為7.6。 細(xì)胞耐酸比耐堿性大一些細(xì)胞

7、耐酸比耐堿性大一些,在偏酸性環(huán)境中更在偏酸性環(huán)境中更 有利于細(xì)胞生長。有利于細(xì)胞生長。 為了維持培養(yǎng)液恒定的為了維持培養(yǎng)液恒定的pH，最常用最常用磷酸緩沖磷酸緩沖劑劑方法。方法。 磷酸緩沖劑中磷酸緩沖劑中NaHco3,可供給可供給CO2但容易逸出，但容易逸出，適用：適用：封閉式培養(yǎng)的細(xì)胞。封閉式培養(yǎng)的細(xì)胞。（無（無CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱） Hanks平衡液平衡液: 含有低濃度含有低濃度的的NaHCO3,當(dāng)打開含有當(dāng)打開含有Hank液培養(yǎng)瓶時(shí)液培養(yǎng)瓶時(shí)，CO2迅速逸出而導(dǎo)致迅速逸出而導(dǎo)致酚酚紅指示劑變紅紅指示劑變紅，表明培養(yǎng)，表明培養(yǎng)液液pH變堿變堿，細(xì)胞，細(xì)胞在堿性的環(huán)境中時(shí)間過長可使細(xì)胞堿中毒。

8、在堿性的環(huán)境中時(shí)間過長可使細(xì)胞堿中毒。 羥乙基哌嗪乙硫磺酸羥乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-Hydroxyethyl Piperazine-N-Ethanesulfonic Acid縮寫縮寫HEPES) HEPES： 對細(xì)胞無毒性也不起緩沖作用，主要作用是：對細(xì)胞無毒性也不起緩沖作用，主要作用是：防止防止pH迅速變動(dòng)，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞迅速變動(dòng)，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能觀察時(shí)能維持恒定的維持恒定的pH。細(xì)胞生存所需基本物質(zhì)細(xì)胞生存所需基本物質(zhì)（四）細(xì)胞生存所需基本物質(zhì)（四）細(xì)胞生存所需基本物質(zhì) 與體內(nèi)基本相同，除碳水化合物、氨基與體內(nèi)基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂類三大類營養(yǎng)物質(zhì)外，一

9、定量的無機(jī)酸、脂類三大類營養(yǎng)物質(zhì)外，一定量的無機(jī)鹽、維生素和微量元素等，但需要的量以及鹽、維生素和微量元素等，但需要的量以及代謝方式與體內(nèi)細(xì)胞不盡相同。代謝方式與體內(nèi)細(xì)胞不盡相同。糖：糖：六碳糖是主要的能源通過糖酵解六碳糖是主要的能源通過糖酵解 形成形成 乳酸和通過檸檬酸乳酸和通過檸檬酸 形成形成 COCO2 2。 胚胎細(xì)胞和一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基胚胎細(xì)胞和一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基中常見到乳酸堆積現(xiàn)象。中常見到乳酸堆積現(xiàn)象。糖是合成某些糖是合成某些氨基酸氨基酸的原料；的原料；經(jīng)過乙酰經(jīng)過乙酰輔酶輔酶A A（CoACoA）合成脂肪合成脂肪；經(jīng)過糖解磷酸通路能經(jīng)過糖解磷酸通路能合成核酸合成核酸。各種糖的

10、吸收取決于它們進(jìn)入細(xì)胞的能各種糖的吸收取決于它們進(jìn)入細(xì)胞的能力力, ,其中葡萄糖最強(qiáng)其中葡萄糖最強(qiáng), ,半乳糖最低。半乳糖最低。2. 氨基酸：氨基酸： 12種氨基酸種氨基酸：精氨酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸胱氨酸(Cyst)、異亮氨酸異亮氨酸(Zle)、亮氨酸亮氨酸(Leu)、賴氨酸賴氨酸(Lys)、蛋氨酸蛋氨酸(Met)、苯丙氨苯丙氨酸酸(Phe)、蘇氨酸蘇氨酸(Thr)、色氨酸色氨酸(Trp)、組組氨酸氨酸(His)、酪氨酸酪氨酸(Tyr)、纈氨酸纈氨酸(Val)是是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的原料。細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的原料。 所有細(xì)胞都需要所有細(xì)胞都需要谷胺酰胺谷胺酰胺，其特殊的作用，其特殊的作用,可促

11、進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜。可促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜。所含的所含的 氨氨 是核酸中嘌呤和嘧啶的來源；是核酸中嘌呤和嘧啶的來源；是合成是合成3，2和一磷酸腺苷時(shí)所需物和一磷酸腺苷時(shí)所需物;是能源和碳的來源。是能源和碳的來源。如沒有谷胺酰胺細(xì)胞生長不良而發(fā)生細(xì)胞死如沒有谷胺酰胺細(xì)胞生長不良而發(fā)生細(xì)胞死亡。所以要求各種培養(yǎng)液中都含有較大量的亡。所以要求各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷胺酰胺谷胺酰胺。 谷胺酰胺谷胺酰胺在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)放置在在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)放置在20冰箱保存，用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。冰箱保存，用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含有已含有谷胺酰胺的培養(yǎng)液在谷胺酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱內(nèi)冰箱內(nèi)可放置可放置時(shí)重新加入

12、原來量的時(shí)重新加入原來量的谷胺酰胺。谷胺酰胺。 需要維生素、生物素、葉酸、胭酰胺、需要維生素、生物素、葉酸、胭酰胺、核黃素、硫胺素、泛酸、吡多醇核黃素、硫胺素、泛酸、吡多醇及及B12等。這些維生素在常用培養(yǎng)基中已成為等。這些維生素在常用培養(yǎng)基中已成為固定組成分。固定組成分。脂溶性維生素脂溶性維生素對細(xì)胞生長也有作用對細(xì)胞生長也有作用,一般一般從從血清血清中得到補(bǔ)充。中得到補(bǔ)充。 3.促生長因子：促生長因子：培養(yǎng)液除營養(yǎng)成分外，培養(yǎng)液除營養(yǎng)成分外，也也需要激素類物質(zhì)起需要激素類物質(zhì)起到促進(jìn)細(xì)胞增殖生長作用。到促進(jìn)細(xì)胞增殖生長作用。胰島素胰島素(110單位單位)促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄

13、糖和氨基酸；氨基酸；氫化可的松氫化可的松(10-810-7M)促進(jìn)表皮上皮細(xì)胞促進(jìn)表皮上皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞增殖生長的作用，提高神經(jīng)和乳腺上皮細(xì)胞增殖生長的作用，提高神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率；膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率； 雌激素和雄激素雌激素和雄激素，或使用黃體酮和氫化，或使用黃體酮和氫化可的松對乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)效果則更好?？傻乃蓪θ橄偕掀ぜ?xì)胞培養(yǎng)效果則更好。血清血清 是提供生長因子和其細(xì)胞所需物質(zhì)是提供生長因子和其細(xì)胞所需物質(zhì)的來源。目前血清、各種組織和其它生物成的來源。目前血清、各種組織和其它生物成分用生物工程的方法提取并商品化。分用生物工程的方法提取并商品化。 4. 其

14、它物質(zhì)其它物質(zhì)： 在細(xì)胞生長過程中在細(xì)胞生長過程中,需要鉀、鈉、鈣、需要鉀、鈉、鈣、鎂氮和磷以外，還需要微量元素，如鐵、鎂氮和磷以外，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒銅、錳、鉬釩等。鋅、硒銅、錳、鉬釩等。 需要需要促細(xì)胞粘附物質(zhì)促細(xì)胞粘附物質(zhì)其作用是：有助其作用是：有助于促細(xì)胞貼附在各種底物或支持物上組于促細(xì)胞貼附在各種底物或支持物上組織生長。織生長。 5.人工培養(yǎng)基：人工培養(yǎng)基： 細(xì)胞在體外的生存環(huán)境是人工模擬的，細(xì)胞在體外的生存環(huán)境是人工模擬的，除注意到無菌、溫度、空氣等條件外，最主除注意到無菌、溫度、空氣等條件外，最主要的是培養(yǎng)基，是供給細(xì)胞營養(yǎng)和保證細(xì)胞要的是培養(yǎng)基，是供給細(xì)胞營養(yǎng)和保證細(xì)

15、胞生長組織的物質(zhì)。生長組織的物質(zhì)。培養(yǎng)基的種類分為培養(yǎng)基的種類分為半固體半固體和和液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基兩類。兩類。 液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：分為合成、天然和無血清培分為合成、天然和無血清培養(yǎng)基三種。養(yǎng)基三種。 A合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基： 成分清楚成分清楚,通過調(diào)節(jié)各種成分的數(shù)量和種通過調(diào)節(jié)各種成分的數(shù)量和種類類,再借觀察細(xì)胞生物狀況反應(yīng)性變化再借觀察細(xì)胞生物狀況反應(yīng)性變化,測定測定細(xì)胞與外界環(huán)境的適應(yīng)能力。借以了解細(xì)細(xì)胞與外界環(huán)境的適應(yīng)能力。借以了解細(xì)胞生存條件胞生存條件,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行定向分化的等。誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行定向分化的等。 合成培養(yǎng)基在應(yīng)用上廣泛。合成培養(yǎng)基在應(yīng)用上廣泛。B天然培養(yǎng)基：天然培

16、養(yǎng)基： 用人或動(dòng)物血清、血漿和胎汁等。常用用人或動(dòng)物血清、血漿和胎汁等。常用牛血清牛血清。血清含有多種促生長因子、貼附。血清含有多種促生長因子、貼附因子及其它活性物質(zhì)等。因子及其它活性物質(zhì)等。加入加入5血清：維持細(xì)胞不死或緩慢生長；血清：維持細(xì)胞不死或緩慢生長；加入加入血清：細(xì)胞增殖生長。血清：細(xì)胞增殖生長。血清的主要作用血清的主要作用提供細(xì)胞生存、生長和增殖所必需的生長調(diào)節(jié)因子。提供細(xì)胞生存、生長和增殖所必需的生長調(diào)節(jié)因子。補(bǔ)充培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。補(bǔ)充培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。含有生長基質(zhì)成分使細(xì)胞易貼附在培養(yǎng)器皿上。含有生長基質(zhì)成分使細(xì)胞易貼附在培養(yǎng)器皿上。提供載體蛋白，

17、可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。提供載體蛋白，可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害。有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害。提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞不受死細(xì)胞釋放的蛋提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞不受死細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。白酶的損害。血清存在的問題血清存在的問題存在有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)。如存在有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)。如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子。補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子。成分不明確，影響對結(jié)果的分析。成分不明確，影響對結(jié)果的分析。不同動(dòng)物、不同批次的血清和活性差別不同動(dòng)物、不同批次的血清和活性差別較大，使培養(yǎng)的結(jié)果不穩(wěn)定。較大，使培養(yǎng)的結(jié)果不穩(wěn)定

18、。C.無血清培養(yǎng)基：無血清培養(yǎng)基： 培養(yǎng)基內(nèi)加入培養(yǎng)基內(nèi)加入促細(xì)胞生長因子促細(xì)胞生長因子，當(dāng)前發(fā)，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)各種促細(xì)胞生長因子已達(dá)幾十種。還有現(xiàn)各種促細(xì)胞生長因子已達(dá)幾十種。還有三碘甲狀腺素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及大鼠頜下腺粗三碘甲狀腺素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及大鼠頜下腺粗提物。提物。具有具有促進(jìn)細(xì)胞生長增殖促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的作用。的作用。 6 .附著底物附著底物: 除少數(shù)懸浮型細(xì)胞外除少數(shù)懸浮型細(xì)胞外,絕大多數(shù)體外培絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞需附著在適宜的底物上生長。不同養(yǎng)細(xì)胞需附著在適宜的底物上生長。不同細(xì)胞對底物要求不同，底物不適對細(xì)胞生細(xì)胞對底物要求不同，底物不適對細(xì)胞生長不良。長不良。常用的底物：常用的底物： A.

19、玻璃：玻璃：如用如用NaOH處理，性質(zhì)能受到一定影處理，性質(zhì)能受到一定影響響;酸中和以后再用（新的鹽酸泡）易碎。酸中和以后再用（新的鹽酸泡）易碎。B.一次性塑料：一次性塑料： 聚苯乙烯聚苯乙烯: 多為一次使用。多為一次使用。聚四氟乙烯包括：聚四氟乙烯包括： 充電荷：充電荷：親水性，適用單層培養(yǎng)親水性，適用單層培養(yǎng)不充電荷：不充電荷：疏水性，適用巨噬細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)疏水性，適用巨噬細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)。胞的培養(yǎng)。聚四氟乙烯透氣性好可制成薄膜，剪成小塊聚四氟乙烯透氣性好可制成薄膜，剪成小塊后放入各種瓶皿中，適于細(xì)胞貼附生長，也后放入各種瓶皿中，適于細(xì)胞貼附生長，也便于取出，可進(jìn)行染色和做電鏡切片。便于

20、取出，可進(jìn)行染色和做電鏡切片。C.微載體：微載體： 由由聚苯乙烯聚苯乙烯和和聚丙烯酰氨聚丙烯酰氨混和混和制成制成 小球體小球體，附著面大，利于大量繁殖細(xì)，附著面大，利于大量繁殖細(xì)胞。胞。D:飼細(xì)胞飼細(xì)胞(Feeder cells)： 也稱為滋養(yǎng)細(xì)胞，也稱為滋養(yǎng)細(xì)胞，用用成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞或其它細(xì)胞長成單層后，用大劑或其它細(xì)胞長成單層后，用大劑量射線照射，使細(xì)胞失去增殖能力，但能存活量射線照射，使細(xì)胞失去增殖能力，但能存活和有代謝活動(dòng)。將其作為和有代謝活動(dòng)。將其作為底物底物，其它細(xì)胞其它細(xì)胞接種接種上面；飼細(xì)胞的代謝產(chǎn)物也有利于其它細(xì)胞生上面；飼細(xì)胞的代謝產(chǎn)物也有利于其它細(xì)胞生長。長。飼細(xì)胞用

21、于：特殊難培養(yǎng)細(xì)胞，飼細(xì)胞用于：特殊難培養(yǎng)細(xì)胞，注意避免注意避免用同用同源細(xì)胞。源細(xì)胞。7.抑制細(xì)胞生長因素抑制細(xì)胞生長因素1.培養(yǎng)液消毒培養(yǎng)液消毒 2.操作不慎使有毒物質(zhì)混在細(xì)胞生存的環(huán)境操作不慎使有毒物質(zhì)混在細(xì)胞生存的環(huán)境中，抑制細(xì)胞生長。中，抑制細(xì)胞生長。3.血清滅活處理可除去補(bǔ)體和降低免疫球蛋血清滅活處理可除去補(bǔ)體和降低免疫球蛋白的毒性白的毒性,并不損傷多肽生長因子，但可能并不損傷多肽生長因子，但可能消滅另一些更有用的營養(yǎng)成分，因此有人消滅另一些更有用的營養(yǎng)成分，因此有人提出，提出，滅活血清不一定比不滅活血清更好。滅活血清不一定比不滅活血清更好。第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 正常細(xì)胞

22、正常細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞 正常細(xì)胞培養(yǎng)正常細(xì)胞培養(yǎng)人或動(dòng)物體外培養(yǎng)都不易，建立細(xì)胞系更難。人或動(dòng)物體外培養(yǎng)都不易，建立細(xì)胞系更難。原因：原因：是分化細(xì)胞；是分化細(xì)胞； 生存條件嚴(yán)格；生存條件嚴(yán)格；目前沒有模擬與體內(nèi)完全一樣的方法；目前沒有模擬與體內(nèi)完全一樣的方法；只要一切條件適當(dāng)時(shí)仍有培養(yǎng)成功的可能；只要一切條件適當(dāng)時(shí)仍有培養(yǎng)成功的可能；初代比傳代容易。初代比傳代容易。體外培養(yǎng)的上皮組織基本特點(diǎn)體外培養(yǎng)的上皮組織基本特點(diǎn)來源：來源：外、內(nèi)、中三個(gè)胚層。外、內(nèi)、中三個(gè)胚層。特征：特征：細(xì)胞排列密集，易形成細(xì)胞排列密集，易形成膜狀膜狀呈貼壁性生呈貼壁性生長。細(xì)胞常相互黏附，具長。細(xì)胞常相互黏附，

23、具有生長的接觸性抑制有生長的接觸性抑制現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 上皮組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能同樣表現(xiàn)上皮組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能同樣表現(xiàn)出出極性極性。細(xì)胞的增殖和分化依賴于細(xì)胞的增殖和分化依賴于促細(xì)胞生長促細(xì)胞生長因子因子的作用。上皮細(xì)的作用。上皮細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)，如微絨毛、胞的特殊結(jié)構(gòu)，如微絨毛、緊密連接、橋粒等，在培養(yǎng)細(xì)胞中也可見到。緊密連接、橋粒等，在培養(yǎng)細(xì)胞中也可見到。 上皮組織的細(xì)胞培養(yǎng)條件上皮組織的細(xì)胞培養(yǎng)條件要求比較高要求比較高，常，常需生長在特殊的需生長在特殊的生長基質(zhì)生長基質(zhì)，極易失去在體，極易失去在體內(nèi)巳有的分化特征，如細(xì)胞極性等。內(nèi)巳有的分化特征，如細(xì)胞極性等。注意：注意： 不僅保證上皮細(xì)胞在

24、體外的不僅保證上皮細(xì)胞在體外的生長和繁殖生長和繁殖；而且應(yīng)盡可能地恢復(fù)而且應(yīng)盡可能地恢復(fù)和誘導(dǎo)上皮細(xì)胞在體和誘導(dǎo)上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的分化。外培養(yǎng)狀態(tài)下的分化。這也是上皮組織體外培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵。這也是上皮組織體外培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵。 上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的特殊條件上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的特殊條件 (1)防范微生物污染：防范微生物污染：根據(jù)上皮組織分布的特性，位于體表或襯根據(jù)上皮組織分布的特性，位于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的上皮組織，直貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的上皮組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機(jī)會(huì)較多。各種病原微生物

25、或受其污染的機(jī)會(huì)較多。要求在組織取材時(shí)就嚴(yán)格滅菌；要求在組織取材時(shí)就嚴(yán)格滅菌；分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都要設(shè)法消除可能會(huì)出現(xiàn)的微生物污染。要設(shè)法消除可能會(huì)出現(xiàn)的微生物污染。培養(yǎng)中所使用的各種液體，包括培養(yǎng)中所使用的各種液體，包括細(xì)胞保細(xì)胞保存液存液、分離液分離液以及以及培養(yǎng)基培養(yǎng)基等需添加等需添加抗生抗生素素，抗生素濃度抗生素濃度比比其它組織培養(yǎng)高。其它組織培養(yǎng)高。 (2)生長基質(zhì)的支持：生長基質(zhì)的支持：上皮細(xì)胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，上皮細(xì)胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，即所謂的貼壁依賴性細(xì)胞。即所謂的貼壁依賴性細(xì)胞。在培養(yǎng)器皿表面包被在培

26、養(yǎng)器皿表面包被生長基質(zhì)，生長基質(zhì)，如如膠原膠原或其或其它它細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)成分等，模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)，成分等，模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)，不僅特別有利于上皮細(xì)胞的貼附和生長，也不僅特別有利于上皮細(xì)胞的貼附和生長，也有利于培養(yǎng)細(xì)胞的分化使細(xì)胞極性表現(xiàn)更有利于培養(yǎng)細(xì)胞的分化使細(xì)胞極性表現(xiàn)更為明顯。為明顯。(3)特殊的培養(yǎng)基：特殊的培養(yǎng)基：培養(yǎng)基有培養(yǎng)基有M199、RPMl 1640、DMEM和和HamFl2。其中其中以以M199和和RPMl 1640較為常用。較為常用。M199和和RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)基僅適用于上皮組僅適用于上皮組織的織的短期培養(yǎng)和維持其生存短期培養(yǎng)和維持其生存，對上皮組織，對上

27、皮組織的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。M199和和RPMl 1640DMEM和和HamFl2培養(yǎng)基用于上皮組織培培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時(shí)有其養(yǎng)時(shí)有其特殊作用特殊作用?？纱龠M(jìn)上皮細(xì)胞的貼附；可促進(jìn)上皮細(xì)胞的貼附；維持上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。維持上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。DMEM和和HamFl2特別適用原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分特別適用原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分中添加中添加微量元素的無機(jī)離子微量元素的無機(jī)離子，更加利于細(xì)胞，更加利于細(xì)胞的生長和代謝。的生長和代謝。在實(shí)際培養(yǎng)時(shí)，將在實(shí)際培養(yǎng)時(shí)，將DMEM與與HamFl2按一定按一定比例混合用于上皮組

28、織培養(yǎng)。比例混合用于上皮組織培養(yǎng)。加入加入血清血清，但出廠血清成分復(fù)雜，含有一定，但出廠血清成分復(fù)雜，含有一定量的有毒物和抑制物。量的有毒物和抑制物。HamFl2培養(yǎng)基培養(yǎng)基的特殊性的特殊性無血清培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中主要添加了各無血清培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中主要添加了各種種促細(xì)胞生長因子促細(xì)胞生長因子，甚至還添加，甚至還添加大鼠頜下大鼠頜下腺腺或或腦垂體的粗提物；腦垂體的粗提物；以促進(jìn)細(xì)胞的生長以促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。無血清培養(yǎng)基對細(xì)胞也有良好的和增殖。無血清培養(yǎng)基對細(xì)胞也有良好的促生長作用，但仍需完善和改進(jìn)。促生長作用，但仍需完善和改進(jìn)。無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基(4)去除成纖維細(xì)胞：去除成纖維細(xì)胞：

29、 上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。取材分離細(xì)胞時(shí)會(huì)帶入少量結(jié)締組織成分，取材分離細(xì)胞時(shí)會(huì)帶入少量結(jié)締組織成分，常常造成成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞混和生長。常常造成成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞混和生長。由于成纖維細(xì)胞具有增殖能力和粘附能力強(qiáng)由于成纖維細(xì)胞具有增殖能力和粘附能力強(qiáng)的特點(diǎn)，很容易的特點(diǎn)，很容易“瘋長瘋長”為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢細(xì)胞群，從而干擾或抑制上皮細(xì)胞的生長，細(xì)胞群，從而干擾或抑制上皮細(xì)胞的生長，成為上皮細(xì)胞的成為上皮細(xì)胞的“細(xì)胞污染源細(xì)胞污染源”。 成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞 因在上皮細(xì)胞因在上皮細(xì)胞的取材、分離、的取材、分離、種、種植

30、和傳代的培養(yǎng)過程中，要特別注意植和傳代的培養(yǎng)過程中，要特別注意上皮細(xì)胞的上皮細(xì)胞的純化，去除和抑制成纖維純化，去除和抑制成纖維細(xì)胞細(xì)胞的生長的生長。 內(nèi)皮細(xì)胞：內(nèi)皮細(xì)胞：來源：人臍帶臍靜脈，動(dòng)物動(dòng)脈來源：人臍帶臍靜脈，動(dòng)物動(dòng)脈消化：用膠原酶比胰蛋白酶消化好。消化：用膠原酶比胰蛋白酶消化好。但要注但要注 意意 掌握掌握 消化時(shí)間和雜細(xì)胞（消化時(shí)間和雜細(xì)胞（成纖成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）。維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）。 如消化時(shí)間過長或操作不慎、刮取過重如消化時(shí)間過長或操作不慎、刮取過重時(shí)，會(huì)造成血管內(nèi)皮下層與外膜成時(shí)，會(huì)造成血管內(nèi)皮下層與外膜成纖維細(xì)纖維細(xì)胞以及中膜平滑肌細(xì)胞胞以及中膜平滑肌細(xì)胞污染。由于這些雜污染。由于這些雜細(xì)胞生長較快，隨著傳代次數(shù)越多，其污細(xì)胞生長較快，隨著傳代次數(shù)越多，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。 介紹排除雜細(xì)胞的方法：介