細(xì)菌內(nèi)毒素和熱原檢查法

1、l 郝樹(shù)彬熱原：注入人體后可引熱原：注入人體后可引起發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)。起發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)。1 材料的致熱性。材料的致熱性。2 因微生物污染造成的熱原反應(yīng)因微生物污染造成的熱原反應(yīng)。l體內(nèi)熱原檢查法兔溫法（PT)l是一種體內(nèi)的、全熱原的檢查方法。1942年USP12版第一次收載。各國(guó)藥典至今仍在使用。l體外熱原檢查法（ITP)l是一種體外的利用人血細(xì)胞反應(yīng)的全熱原檢查法。尚未有藥典收載，歐洲藥典將會(huì)收載。l細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET)l醫(yī)藥工業(yè)普遍接受控制內(nèi)毒素等于控制熱原。l內(nèi)毒素?zé)嵩璴革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分l非內(nèi)毒素?zé)嵩璴除內(nèi)毒素外的熱原熱原檢查法（家兔法）可用于檢測(cè)熱原檢查法（家兔法）可用于

2、檢測(cè)上述兩種原因產(chǎn)生的熱原反應(yīng)。上述兩種原因產(chǎn)生的熱原反應(yīng)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法只檢測(cè)產(chǎn)品的細(xì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法只檢測(cè)產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。菌內(nèi)毒素含量。試驗(yàn)驗(yàn)證未發(fā)現(xiàn)輸液器材料的致熱試驗(yàn)驗(yàn)證未發(fā)現(xiàn)輸液器材料的致熱性，臨床發(fā)生的熱原反應(yīng)均為細(xì)菌內(nèi)毒性，臨床發(fā)生的熱原反應(yīng)均為細(xì)菌內(nèi)毒素污染造成的。因此對(duì)輸液器成品可采素污染造成的。因此對(duì)輸液器成品可采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行熱原初試。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行熱原初試。熱原通常是指能夠致熱的微生物的尸熱原通常是指能夠致熱的微生物的尸體及代謝產(chǎn)物，主要是細(xì)菌的內(nèi)毒素。體及代謝產(chǎn)物，主要是細(xì)菌的內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素：主要存在于革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素：主要存在于革蘭氏

3、陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁內(nèi)，菌體裂解時(shí)釋放出來(lái)。細(xì)菌的細(xì)胞壁內(nèi)，菌體裂解時(shí)釋放出來(lái)。是磷脂，脂多糖和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，是磷脂，脂多糖和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，復(fù)合物中的脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分，復(fù)合物中的脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分，具有特別強(qiáng)的熱原活性。具有特別強(qiáng)的熱原活性。熱原的致熱機(jī)理：細(xì)菌內(nèi)毒素，熱原的致熱機(jī)理：細(xì)菌內(nèi)毒素，病毒，細(xì)菌及其他微生物，類固醇或病毒，細(xì)菌及其他微生物，類固醇或某些材料釋放熱原質(zhì)，作用于動(dòng)物體某些材料釋放熱原質(zhì)，作用于動(dòng)物體單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞后，促單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞后，促使其產(chǎn)生內(nèi)生性熱原，作用于下丘腦使其產(chǎn)生內(nèi)生性熱原，作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，結(jié)果使動(dòng)物

4、體溫升高。體溫調(diào)節(jié)中樞，結(jié)果使動(dòng)物體溫升高。熱原反應(yīng)給臨床治療帶來(lái)極大的危害，熱原反應(yīng)給臨床治療帶來(lái)極大的危害，一般熱原進(jìn)入人體后數(shù)分鐘至一般熱原進(jìn)入人體后數(shù)分鐘至1小時(shí)內(nèi)，即小時(shí)內(nèi)，即會(huì)出現(xiàn)高熱癥狀，反應(yīng)嚴(yán)重者會(huì)造成死亡，會(huì)出現(xiàn)高熱癥狀，反應(yīng)嚴(yán)重者會(huì)造成死亡，故必須嚴(yán)格控制。故必須嚴(yán)格控制。細(xì)菌內(nèi)毒素的理化性質(zhì)細(xì)菌內(nèi)毒素的理化性質(zhì)1 耐熱性：耐熱性：180200攝氏度攝氏度2小時(shí)干熱可小時(shí)干熱可完全破壞。（藥典為完全破壞。（藥典為250攝氏度至少攝氏度至少1小時(shí)。）小時(shí)。） 2 濾過(guò)性：體積極小，可通過(guò)普通濾器。濾過(guò)性：體積極小，可通過(guò)普通濾器。3 水溶性：可溶于水，生產(chǎn)中可用無(wú)熱原水水溶性

5、：可溶于水，生產(chǎn)中可用無(wú)熱原水沖洗以除去熱原。沖洗以除去熱原。4 不揮發(fā)性不揮發(fā)性5 被吸附性：可被樹(shù)脂等吸附除去。被吸附性：可被樹(shù)脂等吸附除去。6 被酸堿破壞被酸堿破壞7 被氧化劑破壞：被氧化劑破壞：30%雙氧水浸泡雙氧水浸泡4小時(shí)，小時(shí)，可完全破壞?？赏耆茐?。l致熱性l致死性l引起血液白細(xì)胞中的粒細(xì)胞下降l激活凝血系統(tǒng)l血壓下降l誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的耐受l引起淋巴細(xì)胞的有絲分裂l誘導(dǎo)抗感染的非特異性l殺死腫瘤細(xì)胞l與鱟試劑反應(yīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法概述：概述：1968年發(fā)現(xiàn)并創(chuàng)造了鱟試驗(yàn)，至今年發(fā)現(xiàn)并創(chuàng)造了鱟試驗(yàn)，至今仍是國(guó)際上通用檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的最簡(jiǎn)便有效仍是國(guó)際上通用檢測(cè)細(xì)菌

6、內(nèi)毒素的最簡(jiǎn)便有效的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于：的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于：1 科學(xué)性：有生物化學(xué)的理論基礎(chǔ)?？茖W(xué)性：有生物化學(xué)的理論基礎(chǔ)。2 準(zhǔn)確性：是酶的分子生化反應(yīng)，專屬性準(zhǔn)確性：是酶的分子生化反應(yīng)，專屬性高，重現(xiàn)性強(qiáng)。高，重現(xiàn)性強(qiáng)。3 靈敏性：鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)靈靈敏性：鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)靈敏度極高，敏度極高，當(dāng)內(nèi)毒素量低到當(dāng)內(nèi)毒素量低到10-10g/ml濃度，它們濃度，它們都能起凝膠反應(yīng)，至今未發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)對(duì)都能起凝膠反應(yīng)，至今未發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)對(duì)鱟試劑的反應(yīng)比細(xì)菌內(nèi)毒素更靈敏。鱟試劑的反應(yīng)比細(xì)菌內(nèi)毒素更靈敏。4 實(shí)用性：方法快速，操作簡(jiǎn)單，無(wú)實(shí)用性：方法快速，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，經(jīng)濟(jì)

7、實(shí)用。需特殊儀器設(shè)備，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的優(yōu)越性，已由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的優(yōu)越性，已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模簱?jù)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集據(jù)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，以判斷醫(yī)療器械或其浸反應(yīng)的機(jī)理，以判斷醫(yī)療器械或其浸提液中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)提液中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法，醫(yī)療器械定的一種方法，醫(yī)療器械/材料須經(jīng)熱材料須經(jīng)熱原實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)證實(shí)無(wú)材料致熱性，同時(shí)原實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)證實(shí)無(wú)材料致熱性，同時(shí)經(jīng)測(cè)定證實(shí)樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)經(jīng)測(cè)定證實(shí)樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無(wú)干擾作用后，才能采用該方法。干擾作用后，才能采用該方法。細(xì)菌內(nèi)

8、毒素在鈣離子，鎂離子參細(xì)菌內(nèi)毒素在鈣離子，鎂離子參與下，激活鱟試劑中與下，激活鱟試劑中c因子，活化的因子，活化的c因因子激活子激活b因子，活化的因子，活化的b因子激活凝固因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支聯(lián)酶作用下形成凝膠。凝固蛋白，在支聯(lián)酶作用下形成凝膠。內(nèi)毒素內(nèi)毒素C因子因子活化活化c因子因子B因子因子活化活化b因子因子凝固酶元凝固酶元凝固酶凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白凝固蛋白凝膠凝膠某些非熱原物某些非熱原物質(zhì)質(zhì)G因子因子活化活化g因子因子實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑：鱟試劑鱟試劑：是從棲生于海洋的無(wú)脊椎動(dòng)物是從棲生于海洋的無(wú)脊椎動(dòng)物“

9、鱟鱟”的藍(lán)色血液中提取的變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低的藍(lán)色血液中提取的變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥精制而成的生物制劑。鱟試劑的溫冷凍干燥精制而成的生物制劑。鱟試劑的生物活性以其能檢出細(xì)菌內(nèi)毒素的最低有效生物活性以其能檢出細(xì)菌內(nèi)毒素的最低有效濃度表示。濃度表示。鱟試劑的靈敏度是用細(xì)菌內(nèi)毒素來(lái)標(biāo)定的，鱟試劑的靈敏度是用細(xì)菌內(nèi)毒素來(lái)標(biāo)定的，因此標(biāo)定鱟試劑靈敏度所用的細(xì)菌內(nèi)毒素必因此標(biāo)定鱟試劑靈敏度所用的細(xì)菌內(nèi)毒素必須是統(tǒng)一且標(biāo)準(zhǔn)的。須是統(tǒng)一且標(biāo)準(zhǔn)的。l細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：系自大腸桿菌細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：系自大腸桿菌提取精制得到的內(nèi)毒素，單位：提取精制得到的內(nèi)毒素，單位：EU.l用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)

10、準(zhǔn)品和標(biāo)定，用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)定，仲裁鱟試劑靈敏度。仲裁鱟試劑靈敏度。l細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：以細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，確定其效國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定，確定其效價(jià)。具備均一性和穩(wěn)定性。價(jià)。具備均一性和穩(wěn)定性。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：指與靈敏度為指與靈敏度為0.03EU/ML或更高靈敏度或更高靈敏度的鱟試劑在的鱟試劑在371條件下條件下24小時(shí)不產(chǎn)生小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。移液管（或刻度吸管，定量移液移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（器）、凝集管（10107575mmmm）、）

11、、三角瓶、三角瓶、小試管（小試管（1616100100mmmm）、）、試管架、洗耳試管架、洗耳球、封口膜或金屬試管帽、時(shí)鐘、脫球、封口膜或金屬試管帽、時(shí)鐘、脫脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。所有玻璃脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。所有玻璃器皿須經(jīng)器皿須經(jīng)180180干烤至少干烤至少2 2小時(shí)。塑料小時(shí)。塑料用具應(yīng)使用其它適宜的除細(xì)菌內(nèi)毒素用具應(yīng)使用其它適宜的除細(xì)菌內(nèi)毒素方法。方法。l75%75%乙醇、蒸餾水、鉻酸洗液。乙醇、蒸餾水、鉻酸洗液。 l試驗(yàn)準(zhǔn)備試驗(yàn)準(zhǔn)備l洗液的配備配制鉻酸洗液或其他適宜洗液的配備配制鉻酸洗液或其他適宜的細(xì)菌內(nèi)毒素滅活劑。的細(xì)菌內(nèi)毒素滅活劑。l玻璃器皿的洗滌將洗滌的玻璃器皿用玻璃器皿的

12、洗滌將洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來(lái)水洗凈并空干水分后置洗洗滌劑和自來(lái)水洗凈并空干水分后置洗液中浸泡液中浸泡4 4小時(shí)，取出，用自來(lái)水將殘余小時(shí)，取出，用自來(lái)水將殘余的洗液洗凈，再用新鮮蒸餾水沖洗干燥的洗液洗凈，再用新鮮蒸餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，置烤箱后置適宜的密閉金屬容器中，置烤箱。 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素，玻璃器皿置箱后將烤箱調(diào)至素，玻璃器皿置箱后將烤箱調(diào)至180180，待烤，待烤箱溫度升到設(shè)定的溫度后開(kāi)始記時(shí)，須干烤至少箱溫度升到設(shè)定的溫度后開(kāi)始記時(shí)，須干烤至少2 2小時(shí)。達(dá)到時(shí)間后，關(guān)斷電源。待烤箱溫度自小時(shí)。達(dá)到時(shí)間后，

13、關(guān)斷電源。待烤箱溫度自然降至室溫，在不開(kāi)啟金屬容器的情況下，可兩然降至室溫，在不開(kāi)啟金屬容器的情況下，可兩周內(nèi)使用，否則須再次加熱除去可能存在的外源周內(nèi)使用，否則須再次加熱除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。性內(nèi)毒素。塑料制品清洗干凈后在塑料制品清洗干凈后在30雙氧水中雙氧水中浸泡浸泡4 h，再用無(wú)熱原水充分沖洗后在再用無(wú)熱原水充分沖洗后在60烘箱烘箱中烘干備用中烘干備用 。l內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備l取取NSENSE或或WSEWSE一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%75%酒精酒精棉球擦拭后啟開(kāi)

14、，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。棉球擦拭后啟開(kāi)，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。l按標(biāo)準(zhǔn)品使用說(shuō)明書(shū)用移液管加入規(guī)定量的按標(biāo)準(zhǔn)品使用說(shuō)明書(shū)用移液管加入規(guī)定量的BETBET水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)。水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)。置旋渦混合器上混合置旋渦混合器上混合1515分鐘，然后制備成所需分鐘，然后制備成所需濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液即濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液即2.02.0、1.0 1.0 ,0.5 , 0.25,0.5 , 0.25（為所復(fù)核鱟試劑的標(biāo)為所復(fù)核鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合混合3030秒（詳細(xì)過(guò)程請(qǐng)參見(jiàn)使用說(shuō)明書(shū)）。秒（

15、詳細(xì)過(guò)程請(qǐng)參見(jiàn)使用說(shuō)明書(shū)）。l例如使用例如使用NSE(NSE(內(nèi)毒素含量為內(nèi)毒素含量為90009000EU/EU/支支) )時(shí)的方時(shí)的方法如下：法如下：l溶解溶解：準(zhǔn)確吸?。簻?zhǔn)確吸取BETBET水水1 1mlml加入加入NSENSE的安瓿內(nèi)，的安瓿內(nèi)，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器混合用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器混合1515分鐘，即為分鐘，即為90009000EU/mlEU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。l稀釋稀釋：?。喝?.30.3mlml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液加上內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液加上2.72.7ml BETml BET水即為水即為110110稀釋液，得到稀釋液，得到900900EU/ml

16、EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)溶液。取取0.30.3mLmL 110 110稀釋液，加上稀釋液，加上2.72.7mLmL BETBET水即為水即為11001100稀釋液，得到稀釋液，得到9090EU/mlEU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。往后依次類推。也可內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。往后依次類推。也可寫(xiě)成下列格式寫(xiě)成下列格式：l9000EU/ml 900EU/ml 90EU/ml 9EU/ml 1EU/ml 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.0625EU/mll在上述稀釋過(guò)程中，每稀釋一步，均須旋渦混在上述稀釋過(guò)程中，每稀釋一步，均須旋渦混合器上混合合器上混合3030秒鐘秒鐘。

17、0.3ml2.7ml2.4ml0.3ml1ml1mll在制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的同 時(shí) ， 取在制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的同 時(shí) ， 取0.10.1ml/ml/支的鱟試劑支的鱟試劑1818支輕彈瓶壁，使粉支輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂輪在瓶頸處輕輕劃痕，末落入瓶底。用砂輪在瓶頸處輕輕劃痕，75%75%乙醇棉球擦拭后啟開(kāi)備用，加入乙醇棉球擦拭后啟開(kāi)備用，加入0.10.1mlBETmlBET水，使鱟試劑充分溶解，避免水，使鱟試劑充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。產(chǎn)生氣泡。l若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.10.1ml/ml/支時(shí)，按標(biāo)示量加入支時(shí)，按標(biāo)示量加入BETBET水溶解，將水溶解，將溶解

18、后的鱟試劑溶液混勻后每溶解后的鱟試劑溶液混勻后每0.10.1mlml分配到分配到10107575mmmm凝聚管中，要求至凝聚管中，要求至少分配少分配1818管備用管備用。將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑1818支支( (管管) )放放在試管架上，排成在試管架上，排成5 5列，其中列，其中4 4支支( (管管)4)4列列分別加入分別加入2.02.0、1.01.0、0.50.5、0.250.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；2 2支支( (管管)1)1列分別加入列分別加入 BETBET水，作為陰性對(duì)照。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液水，作為陰性對(duì)照。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和和BETBET水加樣量

19、均為水加樣量均為0.10.1ml/ml/支。支。結(jié)果判定：結(jié)果判定：將試管從水浴中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)將試管從水浴中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180180時(shí)，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫時(shí)，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為（）；凝膠不能保持者為陽(yáng)性，記錄為（）；凝膠不能保持完整 并 從 管 壁 滑 脫 者 為 陰 性 ， 記 錄 為完整 并 從 管 壁 滑 脫 者 為 陰 性 ， 記 錄 為（）。（）。如最大如最大2.02.0濃度管均為陽(yáng)性，最低濃度濃度管均為陽(yáng)性，最低濃度0.250.2544管均為陰性，陰性對(duì)照為陰性，管均為陰性，陰性對(duì)照為陰性， 按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為按下

20、式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（c c）。）。cclglg-1-1(X/4) (X/4) 式中式中X X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lglg）。）。反反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后四個(gè)呈陽(yáng)性的結(jié)果濃度。四個(gè)呈陽(yáng)性的結(jié)果濃度。陰性0.50.250.1250.0625-+-+-+-+-內(nèi)毒素稀釋液濃度內(nèi)毒素稀釋液濃度 d(EU/ml)X(lgd)0.25-0.602060.25-0.602060.25-0.602060.5-0.30103lX=2.10721l=lg=lg-

21、1-1(-2.10721/4)=0.297(-2.10721/4)=0.297l測(cè)定值在標(biāo)示值的測(cè)定值在標(biāo)示值的50%200%50%200%之間，之間，所標(biāo)示靈敏度可被確認(rèn)，此批鱟試所標(biāo)示靈敏度可被確認(rèn)，此批鱟試劑可用于供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。劑可用于供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。l內(nèi)毒素限值的確定內(nèi)毒素限值的確定l一次性使用輸液器內(nèi)毒素限值為一次性使用輸液器內(nèi)毒素限值為20EU/套套（GB/T14233.2-2005)l供試品溶液的制備供試品溶液的制備l每批輸液器取每批輸液器取3套，管內(nèi)腔注入細(xì)菌內(nèi)毒套，管內(nèi)腔注入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水素檢查用水10mL，反復(fù)蕩洗反復(fù)蕩洗5次后，兩次后，兩端封閉，置端

22、封閉，置37 下下 2h，將腔內(nèi)的液體倒將腔內(nèi)的液體倒入一無(wú)菌無(wú)熱原玻璃容入一無(wú)菌無(wú)熱原玻璃容 器內(nèi)。器內(nèi)。l舉例：所用鱟試劑標(biāo)示靈敏度為舉例：所用鱟試劑標(biāo)示靈敏度為0.25EU/ml,則陽(yáng)性對(duì)照溶液的細(xì)菌內(nèi)毒則陽(yáng)性對(duì)照溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為素濃度為0.5EU/ml.l陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用細(xì)菌內(nèi)毒素檢陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成查用水制成2濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液。濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液。l鱟試劑制備鱟試劑制備l在制備供試品溶液、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的在制備供試品溶液、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的同時(shí)，取同時(shí)，取0.1ml/支的鱟試劑支的鱟試劑6支，手指輕支，手指輕彈瓶壁，使頸部瓶壁上的粉末落入瓶?jī)?nèi)，彈

23、瓶壁，使頸部瓶壁上的粉末落入瓶?jī)?nèi)，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%乙醇棉球乙醇棉球擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)，擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)，加入加入0.1ml/支水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使支水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。l若使用的鱟試劑的規(guī)格不是若使用的鱟試劑的規(guī)格不是0.1ml/支時(shí)，支時(shí)，按標(biāo)示量加入按標(biāo)示量加入BET水復(fù)溶，將溶解后的水復(fù)溶，將溶解后的鱟試劑液混勻后每鱟試劑液混勻后每0.1ml分配到分配到1075m m凝集管中，要求至少分配凝集管中，要求至少分配6管備用。管備用。 l使用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示

24、值小于供試品使用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值小于供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量時(shí)，用檢查用水將供的細(xì)菌內(nèi)毒素限量時(shí)，用檢查用水將供試液稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，公式如下：試液稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，公式如下：l供試液稀釋倍數(shù)供試液稀釋倍數(shù)=X/ lXX供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量l使用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值使用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值l取裝有取裝有0.1ml鱟試劑溶液的鱟試劑溶液的1075mm試管或復(fù)試管或復(fù)溶后的溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿支規(guī)格的鱟試劑原安瓿8支。支。l2支加入支加入0.1ml按按最大有效稀釋倍數(shù)最大有效稀釋倍數(shù)稀釋的供試稀釋的供試品溶液作為供試品試管。品溶液作為供試品試管。l 2支加入支加入0.1ml 2濃度的內(nèi)毒素溶液作為陽(yáng)性濃度的內(nèi)毒素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)照。l2支加