第3、4、5次課生化天然產(chǎn)物化學(xué)(實驗技術(shù))

1、 提取基礎(chǔ) 分離 白樺酸酯 合成（化學(xué)、生物轉(zhuǎn)化）第三講 天然藥物活性成分的提取與分離 重要性：天然藥物的開發(fā)（WTO，知識產(chǎn)權(quán)）一、提取1 文獻2 系統(tǒng)預(yù)試化學(xué)成分種類3 提取溶劑（根據(jù)目的成分選擇） 水（鞣質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)） 冷水、熱水 HCl、NaOH 成鹽溶出 醇 （乙醇、甲醇） 95% alkaloids 60-70% 皂苷、黃酮苷 40-50% 強心苷 丙酮、乙酸乙酯、氯仿等（苷元）4 提取方法（根據(jù)提取目的、要求和條件選擇）冷浸法（3-4次） 滲漉法：熱不穩(wěn)定物、可按極性梯度提取煎煮法（3-4次）回流提取（3-4次）連續(xù)回流提取法超臨界流體萃取超聲波提取微波提取二、分離 1 分類

2、 粗分（部位分離） 細(xì)分（部位分組） 單離（單體成分分離）粗粗分分細(xì)細(xì)分分 2 方法 色譜法（平面色譜、柱色譜、逆流色譜） 結(jié)晶平面色譜平面色譜l 薄層色譜TLC (Thin Layer Chromatograph) 功能：定性分析（預(yù)試、指導(dǎo)分離) 對照標(biāo)準(zhǔn)品 種類：硅膠G, GF254 、RP-18 、聚酰胺 顯色：通用碘、H2SO4/EtOH 專屬alkaloids, flavonoids硅膠H-不含粘合劑；硅膠G-含煅石膏粘合劑；硅膠HF254-含熒光物質(zhì)，可用于波長為254nm紫外光下觀察熒光；硅膠GF254-既含煅石膏又含熒光劑. l 實例：紫杉醇和三尖杉寧堿分離中的跟蹤檢測 展開

3、劑：二氯甲烷正己烷甲醇三乙胺（3.5:4.5:0.5:1）NHOOOOHOOOOHOOOHOOOHl 注意事項： 多元展開劑不能反復(fù)使用，須即配即用； 嚴(yán)格控制組分比例； 預(yù)飽和10min，減少邊緣效應(yīng)l制備薄層色譜PTLC（Preparative TLC） 功能：制備（ 達g 級） 1、吸附劑（adsorbents） 材料：Silica gel 尺寸：20*20, 20*40 cm 厚度：0.5-2 mm 2、樣品帶 手工、自動點樣器 樣品帶寬的解決方法：用極性流動相展開約2cm，使帶變窄用帶濃縮帶的板子3、流動相選擇 三角形法則4、樣品的收集洗脫 顯色：定位 轉(zhuǎn)移 洗脫 5、PTLC制備樣

4、品時引入的雜質(zhì) 粘合劑 雜質(zhì) 指示劑 Other (分解物) (Al2O3 作吸附劑) 解決辦法：Sephedex LH-20 6、TLC技術(shù)的發(fā)展HPTLC巨形板TLC 不銹鋼板 (60*60 cm) ；厚度：5 mm 上樣量 10 g帶濃縮帶TLC二維TLC 多次展開（同方向） 雙向展開l加壓薄層色譜OPLC（Overpressure Layer Chromatography） 又稱 Overpressure TLC (OPTLC) 1、簡介 1979年，HPTLC 吸收HPLC的某些特點： 平面、細(xì)顆粒、蒸氣相、恒流速 2、特點 與傳統(tǒng)PTLC比較 效率 50 mg0.5 g ；1 h3

5、、制備型OPLC 聯(lián)機檢測、分段收集4、應(yīng)用 氨基酸，多肽，胡蘿卜素，生物堿等l 離心薄層層析（CTLC） centrifugal Thin Layer Chromatogram1、概述 CTLC是在TLC和柱色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來，利用旋轉(zhuǎn)離心力，連續(xù)洗脫。2、儀器 傾斜盤、流動相中央進入 梯度、UV檢測、N2保護 固定相活化、反復(fù)使用3、特點（1）分離快速（30min）（2）流動相少（3）進樣量大（4）可梯度洗脫（5）直接檢測，接收靈活（6）色譜板可反復(fù)使用（7）操作簡單，占地小，移動方便柱柱 色色 譜譜Column Chromatogrphyl 常壓柱色譜常壓柱色譜 (0.150 g) （O

6、rdinary Column Chromatogr.） 吸附柱色譜 分配柱色譜 植物有效 柱色譜 離子交換柱色譜 成分分離 凝膠過濾柱色譜 主要手段 聚酰胺柱色譜 大孔吸附樹脂一、吸附性色譜一、吸附性色譜 Al2O3 or Silica gel 生物堿 水溶性 Al2O3 甾體 脂溶性 Silica gel 揮發(fā)油 脂溶性 1 裝柱裝柱 Al2O3：吸附劑 : 樣品 (2050 : 1) (20100 :1) Silica：吸附劑 : 樣品 (30100 : 1) (300400 :1) 1) 干法 與TLC吻合度較好，溶劑消耗少 2) 濕法 緊密，前沿整齊2 上樣上樣 1) 濕法：溶劑溶解上

7、樣（少量），低極性 2) 干法：低極性溶劑溶解性差3 洗脫洗脫 常壓、低壓、梯度洗脫4 收集與檢查收集與檢查 等份 TLC、 UV二、聚酰胺（二、聚酰胺（Polyamide）1 原理原理（1）氫鍵吸附原理）氫鍵吸附原理：基于酰胺鍵 酚類、酸類、醌類、硝基化合物 成氫鍵能力與溶劑有關(guān) 水甲醇乙醇丙酮稀氨液0.2 預(yù)純化操作 四、閃式柱色譜四、閃式柱色譜 （Flash Chromatography) 20世紀(jì)70年代后發(fā)展起來的一種快速柱色譜技術(shù)。1 簡介簡介柱短，分離時間短，快，分離效率高。閃式硅膠（Flash Sicica gel）進口，國產(chǎn)（山東即墨化學(xué)試劑廠）球型微粒，粒度在40-63m（

8、230-400目）之間（均勻）加壓色譜 0.3-1 Kg/cm210 mg-10 g 樣品10-15 min2 操作操作 與普通柱色譜法基本相同。裝柱：濕法 干法（20 cm）上樣：拌樣 濕法洗脫：Rf 0.2-0.3 加液8-10 cm，加壓3 實際應(yīng)用實際應(yīng)用 皂苷、甾體、生物堿、黃酮 五、棒色譜五、棒色譜 （Stick Chromatography)1 簡介簡介 與制備型薄層色譜原理相同,分離量大。把硅膠、氧化鋁等制成園柱形的棒，下端上樣，上行展開而達到分離目的。2 操作操作 l 制棒l 上樣l 展開 引導(dǎo)座兩端相通，內(nèi)填層析硅膠 展開裝置層析槽，密封罩l 收集3 3 應(yīng)用應(yīng)用 生物堿、

9、皂苷、甾醇等l 加壓柱色譜加壓柱色譜 （Pressure Liquid Chromatogr.）類型類型 低壓柱色譜 加壓柱層析 中壓柱色譜 高壓柱色譜優(yōu)點優(yōu)點 分離因子 a 高，故能完成復(fù)雜的分離過程 （ a =兩組分的相對保留時間之比，分離因子是評價色譜柱選擇性的一種指標(biāo)） 制備型與分析型的區(qū)別：制備型與分析型的區(qū)別： 分析型：不要求樣品回收 制備型：要求樣品載量高，因此便要求有特殊的層析 裝置和操作系統(tǒng) 基本原理基本原理 1 加壓柱色譜效果 Speed 分析型 制備型 Resolution Load 與與Load相關(guān)的因素相關(guān)的因素 柱徑、柱長、粒度、填充劑密度 2 加壓柱色譜目的加壓柱

10、色譜目的 得到單體化合物 Lab. 一定純度 生產(chǎn)規(guī)模 回收率 單位時間內(nèi)分得的化合物量 洗脫液流速快 可用更細(xì)的顆粒，分辨率提高 避免不穩(wěn)定化合物在開口柱上由于長時間暴露而導(dǎo)致分解（最大優(yōu)點） 3 分類（分類（Classifcaton） Analytical HPLC: g 5mg Prep. HPLC: 5 mg 1 g Low-pressure LC: 10 mg 1 g Medium-pressure LC: 100 mg 100 g 選擇制備型系統(tǒng)需要考慮選擇制備型系統(tǒng)需要考慮：以上各法的極限（適應(yīng)范圍）根據(jù)以上條件要求而選用的方法上樣量：質(zhì)量超載（少量樣品）or體積超載（多量樣品）

11、柱尺寸，固定相粒度，壓力，洗脫劑經(jīng)驗積累4 操作操作TLC探索條件（色譜系統(tǒng)選擇）分析型小試優(yōu)化條件（超載）套用優(yōu)化條件（制備）正式操作獲得純品分析鑒定純品再生柱：5倍柱體積 正相：actonewatermethanolTHF dichloromethane 反相：watermethanol5 Prep. LC的各種條件的應(yīng)用情況及優(yōu)化的各種條件的應(yīng)用情況及優(yōu)化（1）Column: loading, f, size, column efficiency, a, K number of theoretical plates, resolution（2）Stationary phase: 固液、粒

12、度大小硅膠 普通、鍵合相 AgNO3coated silica gel 涂層AgNO3 分離萜類分開不同雙鍵數(shù)目或位置Paired-ion Chromatogr. 生物堿 在柱上增加一種離子，該離子與欲分離物相反， 從而成為離子對，而成中性，易分離Chiral stationary phase（3）裝柱技術(shù) 加樣法（Sample introduction） 加壓泵（Pump） 檢測器（Detectors） 流動相（Eluent） 分離樣品收集 切割與再循環(huán)技術(shù) 二個成分色帶太近，超出層析靈敏度范圍，分不開時，采取的方法。（樣品通過檢測器不受破壞） 柱超載及中心切割法 要想得量多，需超載，要用中心切割法純化，注意檢測器峰值。一、低壓柱色譜一、低壓柱色譜 （Low-pressure LC）1 簡介簡介 低壓柱色譜可以用玻璃自制，現(xiàn)絕大多數(shù)是購買預(yù)制柱。 長度：從240 mm440 mm 內(nèi)徑：從10 mm37 mm 外徑：從13 mm42 mm L ID OD 進樣量 A 240 10 13 0.3-1ml 0.2g B 310 25 28 1-5ml 1g C 440 37 42 2-10ml 3g2 操作操作 填充劑：40-60m，與TLC相同，流速快 加壓：氮氣瓶 約5bar 機