第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppt-hylogen

1、第七章第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes主講人：羅志勇主講人：羅志勇 教授教授1 1. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（Watson Crick,1953）概概 論論The Nobel Prize in Physiology or Medicine 19622Presentation Speech by Professor A. Engstrm Dr. Francis Crick, Dr. James Watson, Your discovery of

2、the molecular structure of the deoxyribonucleic acid, the substance carrying the heredity, is of utmost importance for our understanding of one of the most vital biological processes. Practically all the scientific disciplines in the life sciences have felt the great impact of your discovery. The fo

3、rmulation of double helical structure of the deoxyribonucleic acid with the specific pairing of the organic bases, opens the most spectacular possibilities for the unravelling of the details of the control and transfer of genetic information.3 Central Dogma2.中心法則提出中心法則提出（Crick，1958）Crick,1916-20044反

4、轉(zhuǎn)錄機(jī)制闡明反轉(zhuǎn)錄機(jī)制闡明（ Temin 1970 ）補(bǔ)充的中心法則補(bǔ)充的中心法則5中心法則：中心法則： 代表了大多數(shù)代表了大多數(shù)生物遺傳信息貯存和表達(dá)生物遺傳信息貯存和表達(dá)的規(guī)律，的規(guī)律，奠定了從分子水奠定了從分子水平研究生命科學(xué)關(guān)鍵問題平研究生命科學(xué)關(guān)鍵問題的理論基礎(chǔ)。的理論基礎(chǔ)。63.基因表達(dá)基因表達(dá)（gene expression）：）： 從從DNADNA到蛋白質(zhì)，通過到蛋白質(zhì)，通過轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄和和翻譯翻譯，用基因的遺傳信息在，用基因的遺傳信息在細(xì)胞內(nèi)合成有功能意義的各種細(xì)胞內(nèi)合成有功能意義的各種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。74.4.基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析技術(shù)：技術(shù)： Northern

5、blot Real -time RT PCR 基因芯片基因芯片DNA序列分析序列分析 Southern blot FISHDNARNAWestern blot 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)8講授內(nèi)容：講授內(nèi)容：( () )DNADNA序列分析序列分析()()核酸分子雜交核酸分子雜交() 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)() 基因芯片和微陣列基因芯片和微陣列 () Western免疫印跡免疫印跡9（一）（一）雙脫氧鏈末端終止法雙脫氧鏈末端終止法 (Sanger ,1977)（二）化學(xué)裂解法（二）化學(xué)裂解法 (Maxam Gilbert ,1977 )（三）（三）DNA自動(dòng)化序列分析自動(dòng)化序列分析

6、一、一、DNA序列分析序列分析10DNA測序技術(shù)基礎(chǔ)：測序技術(shù)基礎(chǔ)： 高分辨率變性聚丙烯酰胺高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技術(shù)技術(shù) PAGE能分離長度為能分離長度為300-500個(gè)堿基個(gè)堿基,差別僅差別僅1個(gè)堿基個(gè)堿基的單的單鏈寡核苷酸鏈寡核苷酸DNA片段。片段。 11(Sanger, UKMaxam Gilbert, USA)共同分享共同分享Nobel化學(xué)獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng)(1979)12( (一）雙脫氧鏈末端終止法一）雙脫氧鏈末端終止法（dideoxy chain termination） 以以DNA合成合成

7、反應(yīng)為基礎(chǔ)。反應(yīng)為基礎(chǔ)。(Sanger)13 ATP、dATP和和ddATP的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)ATPdATPddATP14 DNA合成反應(yīng)合成反應(yīng)摻入摻入N個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸摻入摻入N+1個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸151. 雙脫氧末端終止法原理雙脫氧末端終止法原理 DNADNA合成反應(yīng)中，合成反應(yīng)中，ddNTPddNTP不存不存在在3-OH3-OH末端末端，故不能與下一個(gè)，故不能與下一個(gè)核苷酸的核苷酸的5-P5-P端形成端形成33，5-5-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNADNA新鏈的延伸新鏈的延伸提前終止于提前終止于ddNTPddNTP 。16 末端終止部位末端終止部位DNADNA單鏈模板單鏈模板引物引物

8、延伸的新合成鏈延伸的新合成鏈 摻入摻入ddNTPddNTP172. DNA2. DNA測序主要步驟測序主要步驟 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 單鏈單鏈DNADNA模板的制備模板的制備 DNADNA模板與測序引物退火模板與測序引物退火 摻入法標(biāo)記反應(yīng)摻入法標(biāo)記反應(yīng) 延伸延伸- -終止反應(yīng)終止反應(yīng) 放射自顯影放射自顯影 閱讀測序結(jié)果閱讀測序結(jié)果18測序步驟測序步驟1920G G反應(yīng)管反應(yīng)管A A反應(yīng)管反應(yīng)管C C反應(yīng)管反應(yīng)管G G反應(yīng)管反應(yīng)管T T反應(yīng)管反應(yīng)管21 G A T C22 與末端終止法不同，與末端終止法不同，化學(xué)化學(xué)降解法是建立在對原有降解法是建立在對原有DNADNA的

9、的化學(xué)降解過程基礎(chǔ)上?；瘜W(xué)降解過程基礎(chǔ)上。 （二）化學(xué)裂解法（二）化學(xué)裂解法23 將待測將待測DNADNA片段片段33或或55端進(jìn)行端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記的同位素標(biāo)記，標(biāo)記的DNADNA片段分成四片段分成四個(gè)反應(yīng)，分別用不同的化學(xué)試劑處個(gè)反應(yīng)，分別用不同的化學(xué)試劑處理，造成堿基特異性切割，使理，造成堿基特異性切割，使DNADNA片片段分別于某一種堿基處斷裂。段分別于某一種堿基處斷裂。1.1.化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法原理原理24 化學(xué)降解化學(xué)降解G G反應(yīng)模式圖反應(yīng)模式圖 硫酸二甲酯硫酸二甲酯哌啶哌啶MetMetMetMet25（三）（三）DNA測序自動(dòng)化原理測序自動(dòng)化原理 采用采用4種不同的熒光分

10、別標(biāo)種不同的熒光分別標(biāo)記記4種種ddNTP終止反應(yīng)產(chǎn)物，終止反應(yīng)產(chǎn)物，替代放射性同位素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)替代放射性同位素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA測序自動(dòng)化的基礎(chǔ)。測序自動(dòng)化的基礎(chǔ)。261. DNA自動(dòng)測序步驟：自動(dòng)測序步驟： 4種帶有不同熒光染料標(biāo)種帶有不同熒光染料標(biāo)記的終止物記的終止物ddNTPsSanger測序反應(yīng)測序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離27 熒光信號(hào)采集、計(jì)算機(jī)分析熒光信號(hào)采集、計(jì)算機(jī)分析與與DNA自動(dòng)排序自動(dòng)排序。 激光激發(fā)不同大小激光激發(fā)不同大小DNA片段片段上的熒光分子，發(fā)射出四種上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光不同波長的熒光282. DNA自動(dòng)測序結(jié)果自動(dòng)測序結(jié)

11、果29()核酸分子雜交核酸分子雜交Nucleic Acid Hybridization 30 細(xì)胞原位雜交細(xì)胞原位雜交（Pardue et al， 1969) Southern印跡雜交印跡雜交: 檢測檢測DNA（Southern EM ，1975） Northern印跡雜交印跡雜交: 檢測檢測RNA（Stark GR，1977）核酸分子雜交技術(shù)的建立核酸分子雜交技術(shù)的建立31核酸分子雜交原理核酸分子雜交原理 標(biāo)記的標(biāo)記的單鏈核酸探針單鏈核酸探針與待與待檢測的靶單鏈檢測的靶單鏈DNA或或RNA局部局部互補(bǔ)結(jié)合形成雜交雙鏈?；パa(bǔ)結(jié)合形成雜交雙鏈。 應(yīng)用：應(yīng)用：核酸靶核酸靶DNA或或RNA序列的定性

12、與定量分析。序列的定性與定量分析。3233一、一、Southern印跡雜交印跡雜交(Southern blot hybridization) 將電泳分離的將電泳分離的待測待測DNA片段結(jié)片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。雜交的過程。 34Paper TowelsSouthern Blotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpin35Agarose Gel Electrophoresis_+336二、二、Northern印跡雜交印跡雜交(Northern b

13、lot hybridization) 指將指將RNA變性及電泳分離變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來鑒定其中雜交反應(yīng)來鑒定其中特定特定mRNA分子的含量及其大小。分子的含量及其大小。 37RNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例38GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 雜交分析雜交分析mRNA的表的表達(dá)達(dá)靶靶 mRNA39三、其他雜交技術(shù)三、其他雜交技術(shù)(一一)斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交 (dot blot hy

14、bridization）: 將將RNA或或DNA變性后變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，或尼龍膜上，用于基因組用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究。性及定量研究。40（二）原位雜交（二）原位雜交（in situ hybridization） 用標(biāo)記的核酸探針與組織切用標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測核酸互補(bǔ)序列片或細(xì)胞中的待測核酸互補(bǔ)序列雜交，可對核酸進(jìn)行定性、定位雜交，可對核酸進(jìn)行定性、定位和相對定量分析。和相對定量分析。 41（三）液相雜交（三）液相雜交 (solution hybridization) 1核酸酶核酸酶S1 保

15、護(hù)分析法保護(hù)分析法 (nuclease S1 protection assay） 單鏈單鏈DNA探針與待測探針與待測RNA形成形成DNA/RNA雜交雙鏈，加入核酸酶雜交雙鏈，加入核酸酶S1專一性地降解未形成雜交體的專一性地降解未形成雜交體的DNA或或RNA單鏈，單鏈，DNA/RNA雜交雙鏈則雜交雙鏈則受到保護(hù)而不被降解。受到保護(hù)而不被降解。 422RNA酶保護(hù)分析法酶保護(hù)分析法 （RNase protection assay，RPA）43RPA基本程序：基本程序：待測待測RNARNA的分離的分離體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNARNA探針探針待測待測RNARNA與探針與探針RNARNA進(jìn)行液相雜交

16、進(jìn)行液相雜交 RNA酶消化酶消化不同大小雜交片段凝膠電泳分離不同大小雜交片段凝膠電泳分離44 3. 3.抑制消減雜交原理抑制消減雜交原理（suppression subtractive hybridization，SSH） 以雜交為基礎(chǔ)，并與以雜交為基礎(chǔ)，并與PCR技術(shù)技術(shù)結(jié)合的結(jié)合的cDNA消減雜交方法。消減雜交方法。 應(yīng)用：應(yīng)用：差異表達(dá)新基因的篩選與克隆。差異表達(dá)新基因的篩選與克隆。45SSHSSH原理原理46 cDNA Chip and Microarray () 基因芯片和微陣列基因芯片和微陣列47 基因芯片上的陣列是由有規(guī)基因芯片上的陣列是由有規(guī)則排列的則排列的cDNA或寡核苷酸等

17、樣或寡核苷酸等樣本所組成的本所組成的 。 基因表達(dá)高通量分析法基因表達(dá)高通量分析法。48DNA微陣列：微陣列： cDNA微陣列（微陣列（cDNA microarray） 寡核苷酸微陣列（寡核苷酸微陣列（oligomicroarray）49cDNA微陣列微陣列: 在一微小的基片（硅片等）表面在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子識(shí)別探針，能夠平行集成了大量分子識(shí)別探針，能夠平行分析大量基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此又被稱分析大量基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此又被稱為為cDNA芯片。芯片。50基因表達(dá)譜芯片主要技術(shù)流程：基因表達(dá)譜芯片主要技術(shù)流程：樣品熒光標(biāo)記樣品熒光標(biāo)記芯片制備芯片制備 芯片雜交芯片雜交芯片洗滌和掃

18、描芯片洗滌和掃描 掃描圖像分析掃描圖像分析10251核酸雜交技術(shù)和微陣列芯片核酸雜交技術(shù)和微陣列芯片克隆克隆DNADNAcDNAcDNA標(biāo)記標(biāo)記陣列陣列(Array,Macroarray)雜交、顯影雜交、顯影高密度高密度微陣列微陣列( Microarray )10352CBACy5-標(biāo)記標(biāo)記cDNACy3-標(biāo)記標(biāo)記cDNACBACBACBACBACBACBA樣品樣品1樣品樣品2Cy5/Cy3熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記RNARNA提取提取競爭性雜交顯示競爭性雜交顯示基因表達(dá)量差異基因表達(dá)量差異二種樣品競爭性雜交示意圖二種樣品競爭性雜交示意圖基因表達(dá)譜芯片的原理10453生物學(xué)問題提出，表達(dá)基因分析，生物學(xué)

19、問題提出，表達(dá)基因分析，樣本分類與實(shí)驗(yàn)預(yù)測樣本分類與實(shí)驗(yàn)預(yù)測 .實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基因芯片實(shí)驗(yàn)基因芯片實(shí)驗(yàn)圖象分析圖象分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)譜芯片研究應(yīng)用思路基因表達(dá)譜芯片研究應(yīng)用思路10554某些基因表達(dá)異?；虼嬖诓町惸承┗虮磉_(dá)異常或存在差異生物學(xué)確證和解釋分析生物學(xué)確證和解釋分析下一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)55 cDNAcDNA芯片可定量芯片可定量監(jiān)測大量基因表達(dá)水監(jiān)測大量基因表達(dá)水 平，闡述基因功能，探索疾病原因及平，闡述基因功能，探索疾病原因及 機(jī)制、發(fā)現(xiàn)診斷及治療靶基因機(jī)制、發(fā)現(xiàn)診斷及治療靶基因等。等。cDNAcDNA芯片在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用芯片在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 Northern

20、blot或或RT-PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證。 基因表達(dá)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。56() Western免疫印跡免疫印跡 Western blot原理與核酸分原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)分子。到固相支持物上的蛋白質(zhì)分子。5758Western blot程序：程序： 蛋白質(zhì)樣品制備蛋白質(zhì)樣品制備 SDS-PAGE分離分離 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜 標(biāo)記抗體與膜上蛋白質(zhì)抗原雜交標(biāo)記抗體與膜上蛋白質(zhì)抗原雜交 檢測并分析標(biāo)記物信號(hào)檢測并分析標(biāo)記物信號(hào)59Western免疫

21、印跡信號(hào)檢測原理免疫印跡信號(hào)檢測原理60 Luminol化學(xué)發(fā)光原理化學(xué)發(fā)光原理 61 另一種信號(hào)顯示方法是在另一種信號(hào)顯示方法是在洗去一抗后，加入堿性磷酸酶洗去一抗后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，再用標(biāo)記的二抗，再用BCIPBCIPNBTNBT在在膜上直接顯色。膜上直接顯色。62免疫沉淀技術(shù)免疫沉淀技術(shù) 是一種抗原抗體反應(yīng)技術(shù)，只是將抗是一種抗原抗體反應(yīng)技術(shù)，只是將抗體分子先結(jié)合到固相載體如磁珠上，然后體分子先結(jié)合到固相載體如磁珠上，然后與含目標(biāo)蛋白的細(xì)胞裂解液進(jìn)行液相雜交與含目標(biāo)蛋白的細(xì)胞裂解液進(jìn)行液相雜交反應(yīng)，利用磁場或離心等技術(shù)將結(jié)含在抗反應(yīng)，利用磁場或離心等技術(shù)將結(jié)含在抗體上的蛋白質(zhì)收

22、集起來，電泳分離，用于體上的蛋白質(zhì)收集起來，電泳分離，用于Western blot分析。分析。63() 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerase Chain Reaction64引言引言 PCR技術(shù)發(fā)明技術(shù)發(fā)明（1985，Mullis K.） PCR及其相關(guān)技術(shù)及其相關(guān)技術(shù)發(fā)展速度驚人、發(fā)展速度驚人、 應(yīng)用迅速廣泛應(yīng)用迅速廣泛（分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、考古學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域）（分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、考古學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域） 獲獲Nobel 化學(xué)獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng)（1993， Mullis K. ）65講授內(nèi)容提要講授內(nèi)容提要:一、一、PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理二、耐熱二、耐熱DNADNA聚合酶聚合酶

23、三、三、PCRPCR引物及設(shè)計(jì)原則引物及設(shè)計(jì)原則四、四、PCRPCR條件的優(yōu)化條件的優(yōu)化 五、五、PCRPCR改進(jìn)技術(shù)改進(jìn)技術(shù)66聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) :一、一、PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理 Mullis K. 1985年年發(fā)明的一種模擬天然發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。體外擴(kuò)增技術(shù)。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 67DNA復(fù)制復(fù)制半保留復(fù)制半保留復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制岡崎片段岡崎片段領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈隨從鏈隨從鏈68引物的化學(xué)本質(zhì)是什么？引物的化學(xué)本質(zhì)是什么？單鏈寡核苷酸單鏈寡核苷酸DNA或或RNA

24、片段。片段。DNA復(fù)制引物：單鏈復(fù)制引物：單鏈RNA片段片段PCR引物：引物： 單鏈單鏈DNA片段片段69（一）（一）PCR基本過程基本過程1. PCR循環(huán)由三步組成：循環(huán)由三步組成： 變性變性（denaturation）退火退火（annealing）延伸延伸（extension）70PCR原理原理低溫退火低溫退火高溫變性高溫變性中溫延伸中溫延伸71 在模板在模板DNA、引物、引物、4種種dNTP存在條件下，依賴存在條件下，依賴DNA 聚聚合酶合酶催化一對引物間特異催化一對引物間特異DNA片片段合成段合成的體外擴(kuò)增技術(shù)。的體外擴(kuò)增技術(shù)。 2. PCR定義：定義：723. PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物大小擴(kuò)

25、增終產(chǎn)物大小: 介于兩條退火引物介于兩條退火引物55末末端之間的端之間的雙鏈雙鏈DNA片段片段。734.4.什么叫什么叫引物延伸產(chǎn)物引物延伸產(chǎn)物？ 比兩引物限定區(qū)長的延比兩引物限定區(qū)長的延伸產(chǎn)物。伸產(chǎn)物。僅發(fā)生在以原始模僅發(fā)生在以原始模板板DNA為模板的擴(kuò)增過程中為模板的擴(kuò)增過程中，以倍數(shù)形式擴(kuò)增以倍數(shù)形式擴(kuò)增(2n)。74 Y=A（1+E）n Y: 擴(kuò)增產(chǎn)物的量擴(kuò)增產(chǎn)物的量 A: 最初靶最初靶DNA分子數(shù)分子數(shù) E: PCR擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率 n: 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 5. PCR產(chǎn)量產(chǎn)量 當(dāng)當(dāng)E100, A=1時(shí)時(shí) Y=2n 2n(引物延伸產(chǎn)物的量）引物延伸產(chǎn)物的量）75PCR thermal

26、 cyclerRotor-Gene76PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的瓊瓊脂糖凝膠電泳分析脂糖凝膠電泳分析77（二）平臺(tái)期與平臺(tái)效應(yīng)（二）平臺(tái)期與平臺(tái)效應(yīng)1. 平臺(tái)效應(yīng)平臺(tái)效應(yīng)（plateau effect）：）： PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是片段不再呈指數(shù)累積，而是進(jìn)入靜止期進(jìn)入靜止期即平臺(tái)期即平臺(tái)期。78PCR平臺(tái)效應(yīng)平臺(tái)效應(yīng)792. 平臺(tái)期平臺(tái)期影響因素：影響因素： 引物及引物及dNTP底物濃度降低。底物濃度降低。 酶與模板比例下降。酶與模板比例下降。 實(shí)際應(yīng)用提示實(shí)際應(yīng)用提示： 定量定量PCR應(yīng)考慮平臺(tái)期效應(yīng)，應(yīng)考慮平臺(tái)期效應(yīng)，選擇最適循環(huán)次

27、數(shù)。選擇最適循環(huán)次數(shù)。80二、耐熱二、耐熱DNA聚合酶聚合酶（三）高保真的耐熱（三）高保真的耐熱DNA聚合酶聚合酶（二）（二）Taq DNA聚合酶聚合酶（一）（一）PCR耐熱耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)聚合酶的發(fā)現(xiàn)81（一）一） PCR耐熱耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)聚合酶的發(fā)現(xiàn) 2.T4 與與T7 DNA聚合酶聚合酶:熱穩(wěn)定性差。熱穩(wěn)定性差。1. 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段 ： 熱穩(wěn)定性差，不耐高溫。熱穩(wěn)定性差，不耐高溫。 反應(yīng)溫度偏低，產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。反應(yīng)溫度偏低，產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。3.3.TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶: :實(shí)現(xiàn)了實(shí)現(xiàn)了PCR自動(dòng)化自動(dòng)化82（二）

28、（二）Taq DNA聚合酶聚合酶 從嗜熱水生菌從嗜熱水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分離出來。株中直接分離出來。 基因全長基因全長:2,496 bp 編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì): 832個(gè)個(gè)AA, 94 kd C端結(jié)構(gòu)域端結(jié)構(gòu)域: 53外切酶活外切酶活性性 N端結(jié)構(gòu)域端結(jié)構(gòu)域: 聚合酶活性聚合酶活性HOOCNH2831.1.較高的熱穩(wěn)定性較高的熱穩(wěn)定性 95的半衰期的半衰期: 40 min 最適溫度最適溫度: 72 80 催化反應(yīng)催化反應(yīng)速率速率: 150300核苷酸核苷酸 / 秒秒/ 酶分子酶分子84Taq DNA聚合酶特性：聚合酶特性： 53聚合酶活性；聚合酶活性； 53

29、外切酶活性；外切酶活性； 逆轉(zhuǎn)錄酶活性；逆轉(zhuǎn)錄酶活性； 較弱的非模板依賴性；較弱的非模板依賴性； 缺乏缺乏35外切酶活性。外切酶活性。852. 無機(jī)離子及抑制劑無機(jī)離子及抑制劑 Taq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性對對Mg 2+ 濃度和單價(jià)離子（濃度和單價(jià)離子（K+或或NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。）的性質(zhì)和濃度較敏感。 最適最適Mg 2+濃度濃度：2 mmol/L K+濃度濃度：50 mmol/L863. 保真性保真性DNA聚合酶聚合酶35 外切外切酶活性酶活性核苷酸的錯(cuò)核苷酸的錯(cuò)誤摻入率誤摻入率T4 DNA聚合酶聚合酶1/260 000T7 DNA聚合酶聚合酶1/190 000Kleno

30、w片段片段1/140 000Taq DNA聚合酶聚合酶1/41 00087如何提高如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？聚合酶的保真性？ 使用使用Taq DNA聚合酶時(shí)，聚合酶時(shí)，摻入少量具摻入少量具有有35外切酶活性的耐熱外切酶活性的耐熱DNA聚合聚合酶酶,錯(cuò)配率可降為原來的錯(cuò)配率可降為原來的1/10； 使使四種四種dNTP底物濃度相等底物濃度相等； MgCl2濃度盡可能低；濃度盡可能低； 減少循環(huán)數(shù)。減少循環(huán)數(shù)。88（三）幾種高保真的耐熱（三）幾種高保真的耐熱DNA聚合酶聚合酶 1. Tth DNA聚合酶聚合酶 2. Vent DNA聚合酶聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶聚合酶89三、三

31、、PCR引物及設(shè)計(jì)原則引物及設(shè)計(jì)原則（一）引物設(shè)計(jì)原則（一）引物設(shè)計(jì)原則（二）引物用量計(jì)算（二）引物用量計(jì)算90（一）引物設(shè)計(jì)原則（一）引物設(shè)計(jì)原則 引物序列及其與模板特引物序列及其與模板特異性結(jié)合異性結(jié)合是決定是決定PCR反應(yīng)結(jié)反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。果的關(guān)鍵。911 1.引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則: :引物之間引物之間：避免：避免3端互補(bǔ)端互補(bǔ)92引物自身引物自身：不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)：不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)引物引物5末端堿基末端堿基:可不與模板可不與模板 DNA互補(bǔ)互補(bǔ)引物引物3末端堿基末端堿基：最好選：最好選T、 C、 G，不選，不選A93引物引物5端修飾技術(shù)端修飾技術(shù)附加核酸序列附加核酸序列 用用 途途

32、 限制酶位點(diǎn)限制酶位點(diǎn) 克?。ㄈ缍ㄏ蚩寺。┛寺。ㄈ缍ㄏ蚩寺。┦删w啟動(dòng)子噬菌體啟動(dòng)子 合成合成RNA探針、測序探針、測序蛋白質(zhì)結(jié)合序列蛋白質(zhì)結(jié)合序列 產(chǎn)物純化、檢測產(chǎn)物純化、檢測核糖體結(jié)合序列核糖體結(jié)合序列 高效表達(dá)高效表達(dá)加錯(cuò)配加錯(cuò)配堿基造成突變堿基造成突變 定點(diǎn)誘變定點(diǎn)誘變942. 簡并引物簡并引物（degenerate primers）: 針對某一基因編碼蛋白的針對某一基因編碼蛋白的氨基酸區(qū)域設(shè)計(jì)的一組堿基序氨基酸區(qū)域設(shè)計(jì)的一組堿基序列不同，但有相同堿基數(shù)的寡列不同，但有相同堿基數(shù)的寡核苷酸混合物。核苷酸混合物。95 簡并引物設(shè)計(jì)及簡并引物設(shè)計(jì)及應(yīng)用：應(yīng)用： 對純化的未知蛋白測定一段短對

33、純化的未知蛋白測定一段短 氨基酸序列。氨基酸序列。 不同物種某一基因編碼的保守不同物種某一基因編碼的保守 氨基酸區(qū)域。氨基酸區(qū)域。應(yīng)用應(yīng)用：基于簡并引物：基于簡并引物PCR策略克隆策略克隆 新基因新基因963.3.引物設(shè)計(jì)缺陷而引起的后果引物設(shè)計(jì)缺陷而引起的后果97 4.4.優(yōu)化的引物設(shè)計(jì)實(shí)例優(yōu)化的引物設(shè)計(jì)實(shí)例上游引物序列：上游引物序列： 5GAGAACATGGTGCGCAGGTT 3下游引物序列：下游引物序列：5TGCCCATCATCATGACCTGG 3985 CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGA

34、GCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG GGTCCAGTACTACTACCCGT AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCC

35、AACTGCGCCGACCCC 399100四、四、PCR條件的優(yōu)化條件的優(yōu)化(一一) Taq DNA聚合酶濃度：聚合酶濃度： 1.02.5 U/100 l反應(yīng)液反應(yīng)液 (二二) dNTP濃度：濃度：20200 mol/L (三三) Mg2+濃度：濃度：0.52.5 mmol/L (四四) 引物濃度：引物濃度：0.10.5 mol/L101PCR應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例遺傳病遺傳病診斷：鐮狀細(xì)胞貧血診斷：鐮狀細(xì)胞貧血 6 Glu Val (GAG GUG) PCR擴(kuò)增擴(kuò)增6 DNA區(qū)域區(qū)域傳染病傳染病診斷：診斷：HBV和和HIV腫瘤分子標(biāo)志腫瘤分子標(biāo)志診斷診斷: bcr-abl PML/RAR個(gè)體識(shí)別

36、個(gè)體識(shí)別: 親子鑒定與刑事偵破親子鑒定與刑事偵破生物生物考古考古102五、五、PCR改進(jìn)技術(shù)改進(jìn)技術(shù)（一）（一）RT-PCR (reverse transcription PCR) 以以mRNAmRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAcDNA，再以此，再以此cDNAcDNA為模板進(jìn)為模板進(jìn)行行PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)。103RT-PCR原理原理104逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV（avian myeloblastosis virus） 酶活性最適溫度酶活性最適溫度42 MMLV（Moloney murine leukemia virus）：最適溫度）：最適溫度37 105（二） 定量定量RT-P

37、CR（QRT-PCR） PCR擴(kuò)增指數(shù)期內(nèi)極小的擴(kuò)增效率擴(kuò)增指數(shù)期內(nèi)極小的擴(kuò)增效率改變會(huì)極大地影響產(chǎn)量。改變會(huì)極大地影響產(chǎn)量。1. 半定量半定量RT-PCR 以樣本以樣本mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為模板逆轉(zhuǎn)錄合成合成cDNA，在不同引物對引導(dǎo)，在不同引物對引導(dǎo)下共同下共同PCR擴(kuò)增擴(kuò)增“看家看家”基因基因和和目的基因目的基因cDNA 。106 選擇內(nèi)對照基因選擇內(nèi)對照基因 組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的較恒定的“看家看家”基因基因mRNA。如如GAPDH和和 -actin mRNA等。等。 半定量標(biāo)準(zhǔn)半定量標(biāo)準(zhǔn) 計(jì)算計(jì)算PCR 產(chǎn)物產(chǎn)物 ： 靶靶cDNA /GAPDH cD

38、NA107 RT-PCR驗(yàn)證驗(yàn)證G-Rh2誘導(dǎo)誘導(dǎo)TNFmRNA表達(dá)上調(diào)表達(dá)上調(diào)25mol/L G-Rh2 12 h 24 h 48 h 72 h + + + + TNFGAPDH 舉例舉例1082. Real-time RT-PCR原理：原理： PCR體系加入一種體系加入一種雙色熒光雙色熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針標(biāo)記的寡核苷酸探針，根據(jù)探針，根據(jù)探針上熒光信號(hào)的變化，計(jì)算模板上熒光信號(hào)的變化，計(jì)算模板DNA的含量。的含量。 109 實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR應(yīng)用：應(yīng)用：用于基因用于基因DNA拷貝數(shù)和拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)定量分析。表達(dá)定量分析。110定量檢測定量檢測PCR產(chǎn)物的指示系統(tǒng)產(chǎn)物的指示系統(tǒng): TaqMan和和Molecular Beacon，均 依 賴均 依 賴 熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）。）。111 TaqMan Probe 寡核苷酸探針寡核苷酸探針的的5端標(biāo)記一個(gè)報(bào)端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料（告熒光染料（reporter fluorescence dye），），3端標(biāo)記一個(gè)淬滅染料端標(biāo)記一個(gè)淬滅染料（quencher dye）。）。112 當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激激發(fā)的報(bào)告熒光染料發(fā)的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)移給將能量轉(zhuǎn)移給